2× Hieff Canace® PCR Master Mix 高保真酶预混液

Q：Canace 具有保真性的原理是？错配率是多少？能保证不突变吗？

A: a）原理是具有 3’-5’的核酸外切酶活性，即有校正功能。 b）Taq 酶错配率：2*10-0.0002，大约5kb 有一个碱基发生突变。Canace 约0.00039%，是 taq 酶的 52 倍。 c）高保真酶是突变概率低，但不是绝对的不突变。

Q：Canace 扩增后是平末端产物，如何加 A 尾？

A：仅供参考：先对平末端PCR 产物纯化后，浓度要求至少 20 ng/μL（跑胶图像条带清晰，明亮即可），取14.5 μLPCR 产物，加入 2 μL Taq Buffer，3 μL dNTP，0.5 μL Taq酶，在 72℃反应 10~20 min, 后直接回收纯化加A 尾的DNA 片段。

Q：Canace 能否用于 XX 长度的片段？

A：验证范围内长度理论上是可以的（验证范围：简单模板 20 kb，复杂模板 10 kb）。但具体能否扩出，还与模板和引物等有关。

Q：产物突变？

A：原因 1：模板突变。 1.原始模板序列有突变。 原因：原始模板序列有突变会使扩增产物的突变位点恒定，表现在多个克隆测序发生突变，且突变位置恒定。 判断方法：将模板与 T 载体连接产生的克隆送测序，测序结果与模板序列对比，发生突变且位置恒定，可认为是模板序列发生突变。 优化方法：更换序列正确的模板。

2.保存不当突变。

原因：反复冻融或长时间紫外照射可能导致模板发生断裂或突变，突变位置不定。

判断方法：将模板与 T 载体连接产生的克隆送测序，测序结果与模板序列对比，发生突变且位置不定，可认为是因保存不当导致模板发生了突变。

优化方法：尽量减少模板的反复冻融或紫外照射。原因 2：酶保真性差。

DNA 聚合酶保真性差，导致突变的概率大，在长片段扩增中更常见。

判断方法：将模板与 T 载体连接产生的克隆送测序，模板不突变。以模板扩增得到的产物进行克隆测序后发生突变，且突变位置不恒定，可认为是 PCR 过程中发生的突变， 常是由于酶保真性差导致。

优化方法：更换成保真性更高的产品。注：保真性高低代表突变概率的高低，保真性再高的产品均不能完全避免突变。