2×实时定量PCR扩增预溶液

1.如何根据不同的仪器型号，选用适当的荧光定量试剂呢？

见翌圣生物翌圣生物染料法荧光定量PCR Mix选购表，点击此处查看详情，帮您选择适当的试剂。

2. 试剂用之前如何混匀？

针对分子酶试剂，上下颠倒混匀后，轻微离心即可。不建议剧烈震荡混匀。

3.黄色稀释液怎么用？可以选择不用么？

见说明书，最终需要保证和模板混合后在1×即可。例如20μL cDNA原液，加无菌超纯水180μL稀释10倍，得到200μL稀释模板，取90μL稀释模板，加入10μL 10×Dilution Buffer，混匀后使用即可。可以选择不用，不影响。

4.cDNA模板需要稀释么？该稀释多少倍呢？

可以选择使用cDNA原液或者进行稀释。保证自己想要的基因Ct值落在15-30之间即可。通常cDNA每稀释10倍，Ct值增大3.3。

5.反应体系配制好了，但是排不上机，怎么办？

避光放置，反应体系不能敞口放置，这两项是必要项。可以放在4℃冰箱或者常温中24小时，用之前轻微震荡+离心上机，上机前仔细检查下管子/板子有没有被弄脏。

6.引物设计怎么做？

引物设计时最好跨内含子设计，设计方式参考【过瘾！一文搞懂qPCR引物设计，实验达人必备技能！】，也可以选用验证过的引物，选用方式参考【去哪里找现成的qPCR引物序列？】

7.仪器上数据报告BadRox错误，怎么办？

可能的原因如下：

①仪器长时间没有校准或仪器老化。通常仪器需要每年校准一次，需要请仪器工程师进行校准或替换老化零部件。

②使用了10μL反应体系，正常使用体系是20μL体系，折半使用会导致Rox总浓度过低，发生BadRox的概率上升，建议使用20μL体系进行实验。

8.该产品的qPCR产物能不能跑凝胶电泳？

qPCR产物的特异性通常可以通过熔解程序进行判断。若仍需要通过凝胶电泳的形式判断产物，该产品的qPCR可以进行电泳，电泳需要Loading Buffer，产物不可直接上样电泳。

9.扩增结束后，未出现扩增曲线？

①确认程序中信号采集是否打开。若采用两步法，需将信号采集设置在退火延伸阶段。

②产物长度是否太长。若产物长度设置为500bp及以上，则可能会出现此类情况。建议将在引物设计时，将产物控制在80-300bp之间。

③引物是否不适合。若引物设计不适合，则需要重新设计引物。若引物设计正确但疑似降解，可用PAGE电泳检测引物完整性。

④模板降解：重新制备模板，重复实验。

10.NTC出现CT值，怎么办？

通过观察熔解曲线进行判断分析。

①熔解曲线显示，NTC与对应基因熔解峰形不重叠且NTC的TM值较对应基因的TM值小。该情况下，NTC对应的产物是引物二聚体。若对应基因的熔解曲线峰形都是单一峰，则相关基因信号采集不影响。

②熔解曲线显示，NTC与对应基因熔解峰形重叠。该情况下，NTC对应的产物大概率是对应基因产物。体系受到污染，逐一排查水/引物/试剂是否受到污染，若以上均未受到污染，则可能是气溶胶污染。针对已得到的扩增数据，通过计算NTC与对应基因CT值差值来判断，ΔCT值≥5，表明污染对体系影响小，可忽略。

11.NRT出现CT值，怎们办？

表明存在基因组DNA污染。建议使用去除基因组的RNA提取试剂盒进行RNA提取或反转录时加入去基因组步骤。或者引物在设计时采用跨内含子设计。

12.复孔间重复性差怎么办？

①CT＜30，但是重复性很差怎么办？

• 提升加样准确度。避免小体积加样，减少加样误差，可通过配制大体系的方式保证，例如将引物、水、qPCR Mix混合成大体系或者采用引物和水混合成大体系的方式。大体系需要混合均匀。
• 提升移液器吸取的准确度。移液器通常需要定期校准，一年一校准。

②CT≥30，但是重复性很差怎么办？

此时由于有效模板丰度较低，模板和引物之间碰撞的随机性增大，从而导致复孔间差异变大。可尝试增加2-3个复孔，后续剔除差异大的数据进行数据分析。

13.熔解曲线出现杂峰怎么办？

①熔解曲线杂峰出现在主峰左侧。可能是引物二聚体导致的这类情况，可尝试提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物解决。

②熔解曲线杂峰出现在主峰右侧。

a.是可能由于引物特异性差导致的非特异扩增。需要重新设计引物。

b.是可能由于模板基因组DNA污染。需要建议使用去除基因组的RNA提取试剂盒进行RNA提取或反转录时加入去基因组步骤等方式重新制备cDNA模板。