用国内生物检测义品牌的流式抗体做T细胞分型背景高怎么办？

染色体系也会放大背景。细胞量控制在1×10^6/100 μL左右，染色缓冲液用含0.5-1% BSA或2% FBS的PBS，4度孵育后洗两次，离心力不要太低。上机前先调未染色细胞和单染管电压，确认阴性群落在10^2以下；补偿设置错误也可能让阴性群看起来背景高。如果这些做完仍高，再怀疑抗体本身非特异，换克隆或换荧光标记。可要求供应商提供该克隆的流式数据，但自己实测最可靠。

脾脏单细胞悬液如果裂红不充分、死细胞多、碎片多，阴性群背景很容易被抬高。建议裂红后过70 μm滤网，台盼蓝计活率最好大于90%，染色时加活死染料，如7-AAD或可固定活死染料，上机先圈活细胞。死细胞对多种荧光抗体都有非特异吸附，不解决这一层，换进口抗体也可能背景高。你可以同一样本用国产和进口平行染，同时加活死染料，这样背景差异才有可比性。

小鼠脾脏细胞背景高，建议先不要只降抗体浓度，而是补上Fc Block。脾脏里B细胞、巨噬细胞、DC多，Fc受体丰富，国产和进口抗体都可能因此背景上升。建议用抗小鼠CD16/32单抗，每1×10^6细胞加1-2 μg，4度预封闭10-15分钟，封闭液用含2% FBS或1% BSA的PBS，然后再染CD3/CD4/CD8。如果不做Fc Block，直接和进口比不公平，很多背景是Fc受体或死细胞吸附贡献的，不一定是抗体本身非特异。

1:100只是参考工作浓度，同一克隆不同品牌或不同标记批次，最优浓度差异可能很大。建议用脾脏细胞做滴定：1:50、1:100、1:200、1:400四点，分别看阳性群和阴性群MFI，选择信噪比最高而不是阳性群最亮的浓度。背景高常见原因是浓度偏高或游离荧光素残留，降低到1:200-1:300有时背景明显改善，阳性群仍能分开。同时设FMO对照，不要只依赖同型对照，因为同型本身结合背景也不一定一致。