肿瘤突变检测用NGS建库，起始DNA量不够怎么办？

10-30 ng起始虽然低于说明书50 ng，但很多低起始量NGS建库试剂盒实际可以做到10 ng甚至更低。建议先选标注适用1-50 ng输入或单细胞级建库的产品，不要自己单纯加大PCR循环数，容易造成重复率升高和假阳性。先用1-2个已知突变样本做梯度起始量预实验，比如50、30、10 ng分别建库，看文库产量、复杂度、覆盖均一性和突变检出是否一致。如果10 ng文库复杂度明显下降，就继续优化提取或合并同类样本，而不是盲目上临床。

着急开展的话，先联系试剂商问现货。进口单细胞级或低起始量建库试剂盒货期一般2-6周，国产低起始量试剂盒有的1-2周可发，具体看库存和冷链。可以让供应商提供借用装或试用装，先用标准品跑通流程。开展前一定要做阴性对照和已知阳性标准品，监测背景噪音和假阳性率；如果起始量只有10 ng，建议每个批次都带一个低起始量阳性质控和一个无模板对照，确认污染和扩增偏好都不影响判读。试剂盒到货后别急着上临床，至少完成一批方法学验证。

微量活检组织提取量少，提取环节比建库更值得优化。胰腺癌组织通常核酸降解明显，建议用磁珠法代替沉淀或过柱法，减少转管和干燥损失，洗脱体积尽量压到20-40 μL。建库前先取1-2 μL测Qubit和片段分布，确认小片段比例；如果片段<200 bp占比很高，10 ng起始可能不够，需要提高起始或换用更适合降解FFPE/微量样本的建库方案。全基因组扩增可作为最后手段，但会引入扩增偏好和假阳性，必须设置阴性对照和未扩增平行样本验证。