CRISPR编辑后单克隆筛选用有限稀释还是流式分选更靠谱？T7E1需要多少细胞

293T 贴壁好、单克隆形成率高，没有流式仪用有限稀释完全可行。我的做法是转染后先取混合细胞抽 gDNA 验证，确认有编辑信号后再铺 96 孔板，按每孔 0.3-0.5 个细胞稀释，次日镜下逐孔标记单细胞孔。点突变 HDR 效率波动很大，同源臂长度、模板是 ssODN 还是 dsDNA、转染方式都会影响，经验上从 1% 到 10% 都有，所以别把预期定太高。我通常优先用 ssODN 做模板，同源臂 60-90 nt，并在突变位点附近设计同义突变酶切位点，便于后续快速初筛。

T7E1 酶我惯用 NEB 的 T7 Endonuclease I，分装后 -20℃ 保存，避免反复冻融，稳定性足够日常筛选。Takara 和 Thermo 也有质量稳定的产品；国产同功能酶价格更低、到货快，但切割效率要先用阳性 PCR 产物验证。订货前可以让代理商发小包装，货期一般 3-5 天，价格不算贵。每次酶切务必设野生型 PCR 产物对照，才能判断非特异切割。缓冲液和酶一起按说明书比例加，不要自己改条件，否则条带难解释。

T7E1 不能直接拿 gDNA 酶切，需要先从基因组 PCR 出含编辑位点的片段。我一般用 50-200 ng gDNA 做模板，扩增后取 200-500 ng 纯化 PCR 产物进行变复性和 T7E1 酶切。如果 gDNA 质量差或片段 GC 高，先把 PCR 退火温度和延伸条件优化。点突变引入如果改变了限制性内切酶位点，建议优先做 RFLP 或直接 Sanger 测序，因为 T7E1 对小的 HDR 编辑和某些错配不敏感，容易假阴性。可以把 T7E1 作为初筛，阳性候选再测序确认。

有限稀释最大的坑不在稀释本身，而在消化、吹打和计数误差导致多细胞孔。建议用 0.25% 胰酶消化到单细胞悬液，过 40 μm 滤网，计数后稀释到每 100 μL 0.3 个细胞左右。96 孔板边缘孔加水或 PBS 防止蒸发，影响单克隆生长。挑克隆后先在 48 孔板扩增，冻存一半，另一半抽 gDNA 验证。如果同源臂较长或细胞状态差，可以先加抗性筛选富集，但点突变编辑不能用增加抗性作为唯一证据，最终必须测序确认。