CRISPR文库筛选肿瘤耐药基因，慢病毒包装滴度上不去怎么解决

上清滴度低可以通过浓缩解决。收上清后先 4℃ 离心去细胞碎片，0.45 μm PES 膜过滤，再用超速离心或 PEG/超滤浓缩，通常能把滴度提高 1-2 个数量级。不要反复冻融，分装后 -80℃ 保存。包装时可以在培养基中加丁酸钠或氯喹预处理，也能提高产量。文库实验关键是同一批包装出足够量，避免多批次小包装造成组成偏差。功能滴度要用药筛后计数，别只看 p24 或 qPCR 的物理滴度，后者可能高估。

如果 lentiCRISPR v2 连续包装滴度上不去，可以考虑换成更紧凑的 lentiGuide-Puro 骨架配合 Cas9 稳定细胞，但这会改变实验流程。血清方面建议用热灭活 FBS，293T 对批次敏感，新血清先测生长和转染效率。耗材选 15 cm 皿或细胞工厂放大，滤膜用低蛋白吸附的 PES 膜。想省调试时间可直接用商品化慢病毒包装试剂盒，货期快，配方和质粒比例已优化。国产胎牛血清和耗材一般到货快，但库存波动大，提前备两批。

10^5 TU/mL 未浓缩时偏低但可救。先检查质粒比例，通常 lentiCRISPR v2:psPAX2:pMD2.G 质量比为 4:3:1 或 3:1:1；用 PEI 转染时 DNA:PEI 质量比约 1:3，但不同 PEI 批次有差异，需要小试。293T 细胞用低代数、汇合度 70%-80% 时转染，文库质粒量大时要先在转染复合物中混匀再逐滴加入，避免局部过浓。转染后 6 h 换液，48 h 和 72 h 各收一次上清，合并后浓缩。别只收 48 h 一个点。

文库筛选除了滴度，还要保证文库复杂度。转染时细胞数至少要达到 sgRNA 总数的 200-500 倍，否则滴度再高，代表性也会丢失。放大培养时用 15 cm 皿或细胞工厂，质粒混合物量大要分多管配 PEI，避免局部过浓。设置 GFP 对照监控转染效率，低于 60%-70% 需要重新优化。药筛前先做杀伤曲线确定嘌呤霉素浓度，这样功能滴度才可比。耗材按放大规模提前备货，避免中途缺货影响文库质量。