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全部回答5
梁
梁试剂
2026-09-16
加入1ul逆转录酶后Ct比0.5ul晚，确实可能因为逆转录酶或buffer里的甘油、盐、DTT等被带入后续qPCR。建议先固定cDNA投入量，比如qPCR 20ul体系中cDNA不超过2ul，最好先稀释5倍再取2ul。把加酶量0.5ul和1ul的cDNA同时稀释、同板比较，才能判断是抑制还是模板差异。单看Ct值晚一点点也可能在误差范围内。
G
GenePlus8174
2026-09-11
常规20ul逆转录体系，1ug RNA用200U/ul的M-MLV一般0.5-1ul（100-200U）足够，不是酶越多越好。我自己的习惯是1ug RNA用0.5ul，除非低丰度模板或RNA量大于2ug才加到1ul。AMV或快速耐热酶单位定义不同，要按厂家建议单位数算，不能只看体积。关键是把酶量固定后，统一cDNA稀释倍数，再比较样品间的Ct。
C
CindyScience1595
2026-09-01
建议固定20ul体系：RNA 1ug先65°C预变性5分钟，冰上急冷，加酶和引物。混合引物可先加Oligo dT和随机六聚体室温孵育10分钟，再逆转录。反应温度普通酶42°C 50分钟，耐热型可50-55°C。终止后70°C灭活15分钟，cDNA稀释后做qPCR。若0.5ul酶量已能扩增且熔解曲线单一，就不必加大酶量，优先从cDNA稀释和引物上去优化。
F
Flask
2026-09-20
1ug RNA用随机六聚体+Oligo dT混合引物常见，但随机六聚体比例高会产生大量非特异性cDNA，可能稀释目标模板并增加背景。可尝试Oligo dT:随机六聚体按3:1左右，或仅用Oligo dT；如目标丰度低但RNA完整，可用基因特异性引物。引物策略变化会影响cDNA产物组成和后续qPCR背景，比单纯增加酶量更值得优化。
S
SampleOne4566
2026-09-05
如果怀疑buffer抑制，可做梯度实验：同一cDNA分别加2ul、1ul、0.5ul到qPCR，观察Ct是否随体积减小而提前。若加2ul反而比1ul晚，说明抑制明显，后续将cDNA稀释或减少加入量。也可以把逆转录产物用离心柱纯化后再qPCR，看Ct是否改善。但纯化会损失低丰度模板，样品少时优先降低cDNA加入比例。
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