原代分离鼠胚成纤维细胞，胰蛋白酶浓度和消化时间怎么定？

建议先用0.05%胰蛋白酶-EDTA，不要直接上0.25%。8-10个胚胎的剪碎组织泥，我一般加25-30 mL，37℃水浴轻摇10-15分钟；到第8分钟取一点吹打看是否容易散开，没散就继续，但总时长别超过20分钟。含EDTA不是“猛”在酶本身，而是螯合钙镁让细胞间连接变松，用它是可以的，关键是把时间控制短，消化后立刻血清终止。结团多说明组织剪得不够碎或吹打不足，不一定要加酶量。

我比较推荐多轮消化而不是一次到位。组织块加0.05%胰酶/EDTA后37℃放8-10分钟，轻柔吹打，把上层细胞悬液吸到含15%血清的培养基里终止，剩余组织再补新胰酶重复一轮。血清终止必须做，一般按1:1体积加入含10%FBS的DMEM就够了，之后300g离心5分钟洗掉酶。8-10个胚胎第一次加20-25mL，后面每轮看组织量补10-15mL。这样能避免消化过头，也能提高细胞得率。

结团和消化过头常常是同一批操作里两个极端。我现在的做法是：胚胎去头四肢内脏后，用眼科剪剪到1-2mm糊状，加0.05%胰酶/EDTA后先4℃浸10分钟，再37℃5分钟，期间轻轻摇。消化后加DNase I（终浓度约20-50 μg/mL）能减少DNA释放引起的细胞粘团。吹打用10ml吸管，动作轻慢，不要吹出泡沫，然后过70μm筛，能明显改善结团。0.25%如果要用，建议用PBS或DMEM等量稀释后再试。

如果要做MEF原代，我更倾向用不含EDTA的0.05%胰蛋白酶，37℃ 15分钟以内，组织块量少时容易控制。含EDTA的胰酶对贴壁传代好用，但原代组织解离时EDTA会让消化终点不好判断，时间稍长细胞膜也容易受损。一次处理8-10个胚胎我约加30mL，如果组织块多就分两个50mL离心管，避免堆太厚。终止用血清终浓度10%即可，但建议离心后再用完全培养基洗一次，对后续贴壁影响小。