养细胞想看支原体，吉姆萨染色效果和荧光法差多少？

做支原体简易检测，我建议同时设一个已知阴性的细胞爬片作对照，最好再有一个阳性对照，不然很难判断那些小点是支原体还是染色沉淀。操作上，细胞不要长得太满，固定前用PBS轻洗两遍，避免血清蛋白干扰。染液如果有沉淀要先过滤或换新。判读时建议用100×油镜看多个视野，观察细胞核周围和胞质边缘是否有细小蓝紫色颗粒。不要看到几个颗粒就判定阳性。对间充质干细胞培养，如果后续要发表或用于重要实验，阴性结果不能仅凭吉姆萨，至少用PCR验证一次。

10ml一瓶如果做细胞爬片滴染，每张用0.2-0.5ml，大概能染20-40张，但如果你用染色缸浸没，那缸体大小决定用量，10ml可能只够很小的缸，实际会浪费。预算一百块内买小包装成品工作液通常可行，但要把固定液、PBS、盖玻片和封片剂算进去，否则容易超。购买时看是否即用型，浓缩液还要配缓冲液和量筒。也可以先买10ml试做，确认染出来的背景和对照能接受再补货。

需要固定液，不能用吉姆萨直接染活细胞。我一般用甲醇固定5-10分钟，也有人用甲醇-冰乙酸3:1固定，固定后PBS洗、晾干。细胞爬片要提前铺在盖玻片或腔室载玻片上，汇合度别太高，50%-70%左右更容易看。固定晾干后，用现成吉姆萨工作液染20-30分钟，自来水或PBS从背面冲洗，不要对着细胞面猛冲。染完晾干后用中性树胶封片。时间不是固定死，第一次做最好设20、25、30分钟三个时间点，背景干净且可疑小点对比度最好的是你的条件。

吉姆萨做支原体初筛和荧光法差距主要体现在特异性和敏感性上。吉姆萨能看到胞质或细胞间隙有蓝紫色小点、絮状或毛刺样结构，但这些也可能来自细胞碎片、血清沉淀或染料沉淀，假阳性不低；支原体量低时又容易漏。荧光法如Hoechst 33258染DNA，支原体在细胞核周围呈细小亮点，相对更特异，但需要荧光显微镜。你们经费紧张，可以先用吉姆萨筛可疑，不要用它下最终结论。发现可疑后建议至少用一次PCR或荧光法复核，尤其是间充质干细胞这种后续可能要回输或做实验的细胞。