原代大鼠肝细胞做凋亡，胰酶消化会影响 Annexin V 染色吗？

PI 染完后不建议久放。通常室温避光孵育 15-30 分钟后，在 1 小时内上机比较合适，放得越久 PI 会逐渐进入更多细胞，假阳性会升高。如果一次样本多，可以分批染色，一批上机前再染，或者染完后放冰上避光短时间保存，但不要超过 1 小时。价格方面，50T 和 100T 的单次成本通常大规格更低，但原代实验样本量不大时，先买 50T 验证条件更实际；具体价差要问销售或代理，因为渠道和促销影响较大。

6 孔板一孔是否够要看细胞得率和实验设计。大鼠原代肝细胞一孔接种量常见 2-5×10^5，如果贴壁状态好，一孔收下来做一管染色可能够，但建议每管上机前有 1×10^5-5×10^5 个活细胞，并且还要预留未染管、FITC 单阳管、PI 单阳管。所以不要只养一孔，最好每个处理组至少 2 孔，其中一孔用于计数和单阳对照。若细胞珍贵，先用少量细胞做一次预实验确认得率。

消化后不要立刻染色。建议终止消化后离心，用完全培养基重悬，放在 37℃ 培养箱或室温恢复 30-60 分钟，让细胞膜稳定、表面蛋白恢复。如果是贴壁肝细胞，可以铺回去贴壁 1 小时左右，再温和收集悬浮/贴壁细胞；这一步能明显减少消化带来的 Annexin V 假阳性。恢复期间不要加高浓度血清或刺激剂，保持基础培养基即可。恢复结束后离心，用不含 EDTA 的缓冲液或 binding buffer 重悬，再进入染色。

胰酶消化确实可能造成 Annexin V 假阳性，因为它会损伤膜蛋白和膜脂，部分细胞会把 PS 翻到外表面。原代大鼠肝细胞贴壁牢，不建议用很强或长时间胰酶。可以先用 0.05% 胰酶-EDTA 短时消化，看到细胞变圆就终止；EDTA 残留会影响后续 Annexin V 结合，终止后要用含血清培养基洗一次。如果条件允许，优先用胶原酶或 Accutase 这类温和消化液，比胰酶更合适原代肝细胞。刮刀机械刮取更容易造成膜损伤，尽量避免。