已经提好的质粒内毒素超标，有没有单独去除内毒素的补救方法？

先确认你手上质粒除了内毒素超标，蛋白和 RNA 污染怎么样。普通中提盒子往往这三者一起偏高，单独去内毒素后巨噬细胞状态可能还是不好，所以处理完最好也测一下 A260/A280 和凝胶电泳。300 µg 样品补救前不要全部用完，留出 10~20 µg 作为对照。洗脱要用无内毒素水或 Tris，收集管也要处理过；很多回收率偏低其实是最后一步用普通 EP 管或水引入新内毒素。若处理后仍高于 0.1，可以再过一次柱，但每次重复都会损失 10~20%，要有预期。

已纯化质粒去内毒素，我用过 Thermo 的高容量内毒素去除树脂和国产树脂，处理 300 µg 质粒问题不大。做法是把树脂先活化、平衡，然后与质粒溶液按体积比约 1:5~1:10 混合，室温温和摇 30 min，离心或过空柱收集滤液。回收率受质粒浓度影响，我一般会做到 70~85%；如果初始 2 EU/µg，一步处理可能降到 0.1~0.5 EU/µg，但巨噬细胞最好做两次或增加树脂量。操作时间连检测大约 1.5~2 h。注意所有接触的管和枪头要用无内毒素的。

如果追求快且不想自己装树脂，可以买成品的内毒素去除离心柱，比如 Pierce 或金斯瑞的小柱型。300 µg 样品要根据柱载量算好，一般一次处理量有限，质粒浓度高时先稀释，否则容易堵或回收率下降。成品柱的优点是操作时间短，大概 20~40 min 可完成一次，但价格比树脂贵。你可以先买最小包装试一次；如果效果不够，再决定是否上大包装。处理前后务必用鲎试剂定量，别只看炎症反应，因为巨噬细胞对低水平 LPS 也很敏感，建议目标降到 0.1 EU/µg 以下。

不想买专门柱子的话，可以用 Triton X-114 液相萃取救急。质粒溶液补到一定体积后加终浓度约 1% 的 Triton X-114，冰上混匀，再 37℃ 分相，离心后取上层 DNA 溶液，通常重复 1~2 次。这个方法对内毒素去除比较有效，但 Triton 残留会影响巨噬细胞，所以最后必须用乙醇沉淀或离心柱换液，再用无内毒素水洗脱。300 µg 规模回收率大概 60~80%，时间约 1~1.5 h。我建议先用少量试条件，别一次性处理全部样品，避免回收差还要重新提。