Applications海量干货：手把手教你动物造模(结肠炎、胰腺炎、糖尿病、类风湿关节炎、高血压)

目前有多种动物模型被广泛用于研究炎症性肠炎（inflammatory bowel disease，IBD）的病因、发病机制及测试新开发药物药效等，尤其以葡聚糖硫酸钠盐（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS MW:36000~50000）结肠炎（ulcerative colitis，UC）模型应用最广。

图1.DSS溃疡病结肠炎模型发展历程

通过给予动物自由饮用不同浓度的DSS（MW:36000~50000）水溶液，根据用药时间及用药周期可制成急性和慢性两种结肠炎模型。该模型症状表现与人类UC极为相似，主要表现为腹泻、黏液样便、粪便潜血、肉眼血便、重量减轻、活动度减少，毛色变差等。

表1.DSS结肠炎模型组织学特征

1、症状表现与人UC极度相似，可用于研究急、慢性结肠炎的发生发展机制，也可用于药物的药效研究。

2、自由饮用DSS水溶液的建模方式，简单易行，成模率高，重复性强。

3、用不同浓度的DSS、给药时间和给药频率，可以实现急性和慢性两种结肠炎模型。模型持续时间长，体现了急性向慢性转化的动态过程，解决了UC的慢性化和维持问题，这是以前许多模型无法比拟的。

4、多种属动物中均可造模：小鼠、大鼠、斑马鱼、猪、果蝇等。

5、联合氧化偶氮甲烷 (azoxymethane, AOM)用药，可用于诱发结肠炎相关性癌症 (colitis associated cancer, CAC) 动物模型，成功模拟IBD诱发CAC的过程。

1、小鼠造模

1）BALB/c小鼠，雌，6-8周，25 g；

2）用无菌水配置3% DSS饮用水，然后用0.22 μm的滤膜过滤；

3）给小鼠连续饮用7天，HE染色；

4）实验结果：小鼠的组织水肿充血，有明显的炎症现象。

图2.DSS急性结肠炎切片HE染色结果

2、斑马鱼造模

1）将斑马鱼胚胎培养在含甲基蓝的E3胚胎培养基中，28.5 ℃，培养至1 dpf；

2）用E3培养基配置0.5% DSS饮用水，然后用0.22 μm的滤膜过滤；

3）用0.5%的DSS处理斑马鱼，从3 dpf处理到6 dpf。

4）实验结果：0.5%的DSS药物处理均会导致斑马鱼肝脏颜色变深，产生炎症应激。

图3.DSS导致斑马鱼肝脏产生炎症反应

3、猪造模

1）四到五天大的约克郡小猪，实验组：灌注DSS，对照组：灌注生理盐水

2）每只小猪每日摄入量1.25g DSS/kg，灌注5天

3）实验结果：灌注DSS后，实验组的血浆D-甘露醇摄取率显著高于对照组，表明小猪出现了肉眼可见的肠炎症状。

图4.DSS诱导致小猪体内D-甘露醇浓度高于对照组

4、果蝇造模

1）将5~10日的雌果蝇放在一个装有2.5×2.5×1cm的空小瓶中培养中，用5%蔗糖溶液润湿的3.75-cm色谱纸（Fisher）进料介质；

2）用5%的蔗糖溶液分别配制含有不同成分的喂食培养基，类别包括各含3%的DSS，25 μg/ml博来霉素；

3）果蝇放入含有层析纸的瓶中，29℃培养三天，期间每天将存活的果蝇移入含有新鲜培养基的空瓶中；

4）实验结果：DSS有致死的功能，且DSS诱导ISC前体细胞增殖。

图5.DSS诱导果蝇中ISC前体细胞增殖

1、疾病活跃指数评分（Disease Activity Index, DAI score）

从三个方面进行评估打分，分别为体重、粪便粘稠度、粪便潜血等指标，DAI评分为三个指标之和。

表2.DAI评分细则

2、组织学变化评分

组织学变化评分为上述各指标之和，在急性结肠炎模型中淋巴结形成不做评分。组织学分析的标准方法为HE染色（Cat.NO：60524ES60）。

表3.组织学变化评分

3、结肠长度

急性结肠炎模型中，第8天可检测到结肠长度缩短；慢性结肠炎模型中，结肠长度缩短更加明显。

4、总结

DSS UC动物模型构建应先进行预实验，摸索建模条件，建议预实验每组样本8-10只，并设立对照组。通常出现体重减轻、稀便、腹泻、血便或粪便潜血、溃疡可视为DSS药物有效，造模成功。

翌圣DSS（Cat.NO：60316ES，MW:36000~50000）广泛应用于UC模型的构建。我们发现急性结肠炎成模时间主要集中在7天左右，效果十分显著。下表是部分客户的数据反馈。

表4.用DSS构建不同类型的肠炎模型

产品特点：
1、症状与人类UC高度相似：可用于研究结肠炎发生机制和药效研究。
2、成模率高：自由饮用DSS水溶液，简单易行、重复性强。
3、可构建多种结肠炎模型：急性结肠炎、慢性结肠炎，还可以联合AOM构建结肠炎相关性癌症（CAC）模型。
4、适用于多种属动物造模：小鼠、大鼠、斑马鱼、猪、果蝇等。
5、安全性高：DSS可被自然生态系统降解，对环境安全；
6、纯度高：高纯度（98%），硫含量17-19%；

无论急性DSS结肠炎模型还是慢性DSS结肠炎模型，肠炎严重程度与成功与否均与小鼠种属（不同基因背景）、DSS浓度、给药周期等相关。

表5.DSS结肠炎造模常见问题

热卖产品，建模效率与进口产品一致，产品价格低至进口价格的1/3，大量现货库存。

雨蛙素（Caerulein）是一种功能和组成上类似于胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）的胃调节分子，能够刺激胃、胆管和胰腺分泌。雨蛙素可用于研究由NF-κB上调蛋白如细胞间黏附分子（ICAM-1），炎症相关因子如NADPH氧化酶以及Janus激酶介导的信号转导途径。并已经成功运用于大鼠、小鼠、狗和叙利亚仓鼠等动物急性胰腺炎（AP）模型的建立。

造模优势：

1、操作简单

2、成本较低

3、造模迅速

4、给药方式多

造模机制：

1、通过刺激胞内NF-KB来上调胰腺腺泡细胞内的细胞间黏附分子（ICAM-1）表达。表面ICAM-1反过来促进中性粒细胞粘附到腺泡细胞上从而增强胰腺炎症效应；

2、通过诱使消化酶分泌失调和细胞质空泡化导致腺泡细胞死亡和胰腺水肿，从而诱导胰腺炎；

3、活化炎症促进因子。

相关试剂：

翌圣提供十肽分子形式，纯度≥97% (HPLC)雨蛙素；造模效率高，价格优惠，现货供应。

链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）是从某种链霉菌Aureobasidium pullulans中产生的抗肿瘤类抗生素，也可人工合成。常被用于治疗胰腺癌。同时，STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造动物模型。在抗白血病、DNA甲基化、抗肾炎等方面被广泛研究。

1、动物的准备

尽量选用雄性动物，雌性含有激素影响建模效率。有研究显示，雌性动物成模率差，而且可能会比雄性出现更高死亡率，尤其是I型。

I型糖尿病（Type I diabetes）一般按照体重选择即可，推荐大鼠170-200g，小鼠17-22g，适应性喂养1~2周后空腹注射STZ，成模率相对理想。

II型糖尿病（Type II diabetes）对于大鼠（比如SD/Wistar），选取4-5周龄，体重在90-100g，高脂（高糖）饲料喂养4-6周体重约达240-280g。 对于小鼠（比如C57/ICR/昆明小鼠），选取4-5周龄，体重在16-20g，高脂（高糖）饲料喂养4-6周体重约达30-35g。 对于新购入动物或更换饲养环境需要先用普通饲料适应性喂养一周，然后再选择适合周龄/体重动物转用高脂高糖饲料继续喂养。从模型建立成功率来看，大鼠推荐用SD，小鼠推荐C57。

2、造模前的喂养

造膜前的喂养，Ⅰ型糖尿病模型成模比较快，通常大鼠在普通饲料适应性喂养2周后即可开始造模；Ⅱ型糖尿病模型：高脂饮食诱导加小剂量STZ。造模前喂以高脂(高糖)饲料，诱发出胰岛素抵抗。

3、试剂的准备

①高脂(高糖)饲料

高脂(高糖)饲料成分：其中含10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇

由基础鼠饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按质量比搭配制作高脂高糖饲料：其比例为猪油18 % ,蔗糖20 % ,蛋黄3 % ,基础饲料59 %。

②STZ溶剂——柠檬酸钠缓冲液的配制

A液和B液的配制：称取柠檬酸(FW:210.14) 2.1g加入双蒸水100mL中配成A液；称取柠檬酸钠(FW:294.10) 2.94g加入双蒸水100mL中配成B液。

柠檬酸钠缓冲液的配制：将A、B液按一定比例混合（1：1.32也有按1:1的），pH计测定pH值，调节pH值到4.2-4.5，即是所需柠檬酸钠缓冲液。

4、注射前准备

配制STZ注射液前，STZ冻干粉放置于干燥灭菌瓶内，外用铝箔纸或锡纸包好，与柠檬酸钠缓冲液一起置于冰浴预冷，带到动物房备用。

注意：STZ冻干粉从−20°C冰箱取出后，于室温干燥避光放置10min左右，使其彻底解冻（很重要）。

5、配制注射液

大鼠过夜禁食（不禁水）后称重并测血糖浓度。对大鼠进行分组，以便按照动物数目和注射剂量来准备STZ注射液。以1%浓度（w/V）溶解STZ，过滤消毒，切记STZ完全溶解。

注意：

①STZ不稳定，易失活，快速称取后剩余试剂仍要求干燥避光，推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸包裹。

②注射时若操作不熟练，切忌不可一次性溶解完STZ。建议根据操作熟练度，分组溶解STZ，比如10只或15只鼠/组。

③亦可提前将STZ按动物分组的所需量称重，分装。

6、注射

按动物空腹体重腹腔或尾静脉注射。如果注射操作技术不熟练，应两组交替注射，注射应在30分钟内完毕。注意：注射大多要求快速注射。

注意：

Ⅰ型糖尿病模型：大鼠剂量为70～65mg/kg

Ⅱ型糖尿病模型：高糖高脂喂养1～2 个月的大鼠,STZ 剂量在25～40mg/kg。

7、注射后

注射完STZ后要给予动物足够的水、食物（糖尿病鼠的基本生活特征），需每日换垫料，保持鼠笼干燥。饲养时，注意避免强日光照射。尽可能勤消毒。

注意：STZ造模后，明显血糖水平波动呈现3个时相，一时性高血糖（1-2h）、短暂低血糖（6-10h）、持续高血糖（>72h）。必须适当补给胰岛素和葡萄糖。

与对照组对比，统计以下指标：

1、一般性指标：出现多饮、多食、多尿现象，体重下降；

2、其他指标：空腹血糖、空腹血清胰岛素水平、血清胰岛素水平、胰岛素敏感性、糖耐量等；

3、血清生化指标：T-Cho、TG、HDL-C、LDL-C、CR、BUN、Alt等；

4、病理切片：胰腺组织病理切片。

1、STZ的品质是关键，建模用STZ纯度应不低于98%（HPLC检测）；
2、STZ失效：应干燥保存，避免受潮。粉末避免长时间室温放置，溶解的STZ是非常不稳定的，在中性pH值的半衰期为15分钟。注意用酸性pH值溶解STZ，最好放在冰浴里；
3、腹腔注射是否注射到肠子等脏器。

模型不达标者，建议，再观察3天，还是不成模型的话，重新注射一次。

1、鼠的体重过低；

2、 一定要保证足够的饮水量(饮水量不足容易导致死鼠);

3、高血糖和低血糖都会造成死鼠，避免死鼠可以通过注射胰岛素或暂时补糖，两种途径： ①常见为血糖过高。补胰岛素法，补一些中效胰岛素。例如给诺和灵n或NPH(中性鱼精蛋白锌胰岛素),每次2-3个单位，过了3-5天，大鼠一般死亡率就低了；②补糖法，禁食后的鼠，注射的时候已经处于低血糖状态，造模4小时后腹腔注射20%的葡萄糖，可避免因注射时血糖过低死鼠；

4、防止动物自相残杀。食物缺乏和供水不足的情况下，会互相撕杀、啃食同类，所以食物和饮水要供应充足，最好是两路供应;

5、防止感染。糖尿病大鼠尿量多，垫料潮湿，需要勤换垫料，所以糖尿病大鼠较其他大鼠容易出现感染，特别是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后，要注意消毒工作。如每次采血测血糖后可用四环素(或金霉素眼药膏)局部涂抹处理伤口预防感染。

糖尿病疾病模型的影响因素包括STZ建模试剂的质量、动物状况及给药方式等。其中，试剂主要性能为纯度、稳定性、溶解特性等，动物状况主要包括遗传背景，雌雄，性别，体重，饲养环境，饮食结构等，给药方式包括给药时间、给药间隔和给药途径。差异化的因素带来差异化的建模效果。

影响因素标准化是实现建模目的及建模稳定性的保证。理论上，所有的动物建模实验均要求预实验。

以STZ诱导糖尿病模型而言，实验时STZ的给药量应参照预实验的结果，尽量不要盲目按照文献上或他人的给药量来直接使用，鼠均重和空腹(低糖状态)抗药力、禁食时长、注射选时、以及之前饲养过程、测糖选时等都不相同，通过预实验来确定符合自己实验鼠的给药计量，才是最科学的。

STZ保存、溶解、分装等使用注意事项，详见官网相关试剂。

高成功率：纯度≥98%（HPLC测定）；质量稳定，性价比高，现货供应，售后保障。

（了解更多STZ造模的使用，可查看翌圣官网专题文章）

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性关节疾病，表现为持续性滑膜炎、全身性炎症，伴有骨骼和软骨侵蚀，最终可导致关节强直和畸形，常见的诱导模型有胶原诱导关节炎（CIA）和佐剂诱导的关节炎（AA）。

弗氏佐剂(Freunds Adjuvant)由Jules Freund在20世纪40年代发明，它是将抗原水溶液与油剂等量混合，再加乳化剂制成油包水的抗原乳剂，是目前动物实验中最常用的佐剂。弗氏佐剂分为含结核杆菌的弗氏完全佐剂(Complete Freund's Adjuvant, CFA)和不含结核杆菌的弗氏不完全佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)，主要用来诱导小鼠胶原诱导的关节炎CIA模型和佐剂诱导的关节炎AA模型。

1. 胶原诱导性关节炎 (collagen-induced arthritis,CIA)建模步骤（仅供参考）

1）准备相关试剂，注意设置实验组与对照组。

2）将牛二型胶原（CⅡ）溶于冰乙酸溶液中，浓度2 mg/mL，4℃过夜。

3）弗氏不完全佐剂补加已灭活的结核杆菌，使其浓度达2-5 mg/mL，配制成弗氏完全佐剂。翌圣生物提供的60718ES弗氏完全佐剂中结核杆菌浓度小于10 mg/mL。

4）将牛二型胶原（CⅡ）乙酸溶液与弗氏完全佐剂等量混合并乳化。

5）每只实验小鼠背部进行皮下注射，总共0.1-0.2 mL。

6）3周后用弗氏不完全佐剂，与牛二型胶原（CⅡ）乙酸溶液等量混合并乳化，每只小鼠尾根部进行皮下注射，总共0.1-0.2 mL。

7）病理检查：取实验组和对照组小鼠，去外皮，4%甲醛固定48 h以上，5%硝酸脱钙2 h，二甲苯浸润，石蜡包埋。制成切片，进行HE染色，用常规光学显微镜观察。

2.佐剂诱导的关节炎(adjuvant Arthritis,AA)建模步骤（仅供参考）

1）准备相关试剂，注意设置实验组与对照组。

2）观察记录：一般在第二次免疫后7-12天小鼠80%以上出现关节炎症状。根据小鼠关节部位红肿及活动程度进行临床症状分级，在实验前和实验后的第3，5，7，12天分别观察记录，等级区分参考如下：

表1.组织学变化评分

3）小鼠测定：采用小鼠爪足体积测量计测定实验前后小鼠后肢关节体积，测量每只小鼠后腿膝关节约5 mm以下体积，重复三次，记录取平均值，每三天检测一次。

4）病理检查：取实验组和对照组小鼠，去外皮，4%甲醛固定48 h以上，5%硝酸脱钙2 h，二甲苯浸润，石蜡包埋。制成切片，进行HE染色，用常规光学显微镜观察。

3.实验案例图片（文献中摘录）

图1.不同时间点各组大鼠膝关节滑膜和踝关节HE染色结果比较图

综上图片说明，IFA+CII组病理变化特点和 CFA+CII组一样明显，但CFA+CII组病理变化更加严重和明显。

4.常见问题

5.相关产品推荐