Techniques怪不得实验总是做不好，原来是忽略了核酸质控！

小翌一个正在读研的师弟最近因为实验进度的滞后被老板催的厉害，所以在聊天的时候很苦恼：为什么我的qPCR实验怎么老是做不好？昨天的文库产量还是那么低…….其实大多时候实验结果不佳的原因往往不在于实验试剂，也不在于实验操作，而在于一个简单却又易被忽视的问题：
核酸样本质控。

核算质控是什么？

核酸质控，顾名思义就是对核酸样本进行质量控制。主要是评估核酸的完整性、浓度及纯度。

核酸质控对实验有什么影响？

核酸样本涉及的下游实验很多，质控不合格会影响实验结果的准确性，甚至得到错误的研究结论。

1）DNA样本质控不合格影响文库产量以及文库丰度

对于DNA测序来说，样本质控不合格最直观的呈现就是文库产量低。而低数量（浓度）、低质量样本均会影响最终文库的丰度（图1）。文库丰度越高，代表文库承载的样本原始信息越多，最终目标区域会获得更有效的测序数据覆盖[1]。

图1 DNA质量对于文库丰度的影响

A. 足够数量的高质量DNA分子能够产生高丰度的文库，很好的呈现起始样本信息；

B. 低数量、高质量的DNA分子产生低丰度的文库，不能够完全代表起始样本；

C. 质量较差的DNA样本则会产生低丰度的文库，因为已经损伤的DNA无法被构建文库；

D. 某些情况下，低质量的样本可以通过增加起始投入量来适度弥补文库丰度[1]。

文库构建所需样本量与试剂盒的性能有关，微量高效建库试剂盒如翌圣Ultima建库试剂盒起始量低至500 pg亦可高效建库。即使低质量样本如FFPE，微量样本如cfDNA均可获得优异的文库。

2）RNA样本质控不合格影响qPCR定量的准确性

研究表明RNA样本的RIN值与qPCR实验的Ct值相关，RIN值越高（代表质量越好），则CT值越低[2]（图2）。

图2. RNA的RIN值与Ct值的关系。RIN：RNA Integrity Number，原理同DIN值

qPCR实验建议用于逆转录的RNA样本RIN值>7。此外还可以通过琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整度（一般三条带）。纯度测定A260/A280=1.8-2.0（＜1.8时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存），A260/A230>2（＜2表明有异硫氰酸胍，β-巯基乙醇或乙醇的残留；）。

核酸“体检”指南

对于高质量的样本来说，基于紫外吸收法原理检测的Nanodrop、基于荧光非特异性结合的原理检测的Qubit以及常规的琼脂糖凝胶电泳均可做出全面的质控结果。

1）NanoDrop

核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及碱基构成。由于碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波长为260 nm。根据朗伯比尔定律可计算核酸浓度。此外根据A260/A280和A260/A230的数值可以评估核酸的纯度。

常见应用：DNA/RNA浓度测定，纯度评估

图3. NanoDrop全家福

2）Qubit

Qubit基于荧光染料非特异性结合dsDNA的双链，在特定的波长光源激发下，发出荧光，根据荧光强度可以对原始的样本进行定量。因而只要选择特异性的DNA/RNA染料就能有选择的定量样本中的核酸浓度。

常见应用：dsDNA定量如NGS文库定量等

图4. Qubit 4.0及其配套试剂

3）核酸电泳

DNA在碱性条件下带负电荷，在电场中往正极移动，不同DNA由于分子构型不同，在电场中的迁移速率不同，将不同大小的条带区分开。

常见应用：DNA/RNA完整性评估，纯度评估等。

除了常规的高质量样本之外，基因应用领域中还存在低质量的样本，如FFPE样本（石蜡包埋）。针对这类样本在常规的浓度纯度检测之外，还需进一步评估。

4）短序列PCR扩增产物的比值

低质量样本随着时间的延长会慢慢的片段化，因而可以通过对广泛存在于gDNA的短序列Alu序列（Alu 247与Alu 115）的扩增产物或者不同qPCR扩增产物的浓度比值来衡量DNA的完整性；

注：Alu247/Alu115：Alu序列是广泛分布于人基因组的约300bp短重复序列。通过长 (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 扩增子比值可评估gDNA的完整度。

Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR扩增产物浓度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分别指129bp和41bp产物、305bp和41bp产物浓度比值。

表1 低质量样本质控

5） 样本DIN值：即 DNA Integrity Number

DIN值是指DNA经安捷伦生物分析系统分析结合软件算法计算的数值。高度完整的 gDNA 样品在胶图中以单片段形式迁移，在电泳图中则显示为在最大分子量标准峰 (48500 bp) 之上的一个界限清晰的峰。随着降解程度的增加，一些 gDNA 小片段的肩峰开始形成，且主峰朝着小分子量的方向偏移。高度降解的 gDNA 在胶图中呈现弥散条带状，并在电泳图中迁移为分子量低于 2000 bp 的宽峰（图5）。

图5. 不同样本降解程度对应的DNA完整值，从右往左DNA降解程度不断增加，而样本的DIN值不断降低。

DIN 通过评估信号在分子量范围内的分布来测定基因组 DNA 的降解程度，将每个样品信号与其他所有信号进行对比，从而生成 DIN值。

IDT曾使用了DIN值和Q129/Q41来对不同FFPE样本DNA进行质量检测，结果显示DIN值和Q129/Q41具有很好的相关性(图6)

图6. 不同质控参数对FFPE样本(Blocks 1–5)的DNA质量评估显示DIN值和Q129/Q41具有很好的相关性。

几种常见的核酸质控方法对比

参考文献：

[1]. http://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/application-note/dna-enrichment-from-ffpe-samples-using-xgen-lockdown-probes.pdf?sfvrsn=f7b33707_8

[2]. Fleige S, Walf V, Huch S, et al. Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time RT-PCR.[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(19):1601-1613.