Techniques单点/多点定点突变随心变—想变哪里变哪里

定点突变技术是利用PCR等技术定向改变基因的特定碱基序列，是研究基因功能和蛋白功能的一种非常有用的手段。通过该技术，可迅速，高效提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，从而来阐明目的基因的调控机理，以及下游实验中的蛋白质结构与功能的关系。

翌圣生物推出的定点突变试剂盒基于Hieff Clone®快速克隆技术的定点突变系统，目标质粒扩增产物经DpnI消化、Hieff Clone^®重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。高效快速的实现直接对目标质粒中的靶位点进行单点突变，多点突变，以及插入或缺失等。

» 扩增性能优越：超高保真酶可扩增长度小于20kb的任何质粒

» 高效DpnI酶：可充分有效降解未突变的质粒模板

» 引物设计与目标质粒扩增

反向PCR引物中需引入同源臂和突变位点。

» DpnI 消化质粒模板

质粒模板来源于大肠杆菌，为dam甲基化修饰，对DpnI敏感而被切碎。反向PCR合成的带突变位点的线性化质粒因没有甲基化而不被切开。

»重组反应

同源臂在重组酶的作用下进行重组。

图1.进行单碱基（或多碱基）定点突变实验流程

[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF37.205）

[2]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019.（IF31.398）

[3]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16. （IF31.398）

[4]. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria[J]. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1145-1158.（IF 20.46）

[5]. Li X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection[J]. Mol Cell. 2017 Jul 20;67(2):214-227.e7.（IF14.548）

[6]. Yao R W, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus[J]. Molecular cell, 2019.（IF14.548）

Q1. 请问单点突变/多点突变是否都是每个位点设计一对引物？是否都包括碱基/氨基酸突变，碱基插入和缺失？碱基插入/缺失的最大长度是多少?是否可以进行连续氨基酸的突变，氨基酸的数量限制是多少？

A1：单点突变/多点突变是每个位点设计一对引物；正反向引物可以包括碱基/氨基酸突变，碱基插入和缺失，也可以将这些放在一条引物上；碱基插入/缺失的最大长度没有限制，可为任何长度；可以进行连续氨基酸的突变，无特别数量限制。

Q2. 引物设计的原则是什么？有无官网的引物设计软件，若没有，推荐几个好用的引物设计软件。

A2：引物设计基本原则是使扩增产物末端有同源序列即可。无官方设计软件，推荐软件Primer5，Vector NTI。

Q3. 本试剂盒可以进行多点突变，能够同时进行几个位点的突变? 突变效率如何?进行单点突变的突变效率是多少？

A3：最高同时突变6个独立位点（每个位点之间相距超过100bp）。突变效率非常高（单次反应500多个克隆，阳性率超过95%）。

Q4. 该kit不含有感受态细胞，推荐的感受态细胞是哪些？
A4：Top10、DH5α、JM109等常规感受态。