Case StudiesTHP-1细胞诱导M1/M2型巨噬细胞实验方案

实验原理

THP-1细胞为悬浮生长的人单核细胞系，PMA可激活蛋白激酶C（PKC）信号通路，促使其周期停滞、表达黏附分子，分化为贴壁生长的M0型巨噬细胞（具备巨噬细胞基础表型与功能）。后续通过不同细胞因子微环境调控极化方向：LPS（脂多糖）联合IFN-γ可激活NF-κB通路，诱导M0向促炎的M1型极化，高表达促炎因子与CD86等标志物；IL-4联合IL-13可激活JAK-STAT6通路，诱导向抗炎修复型M2极化，高表达抗炎因子与CD206等标志物。

实验步骤

一、THP-1细胞预处理与M0诱导

1.细胞准备：取出培养箱中的THP-1细胞，轻轻吹打均匀，取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝混合，计数板计数，调整细胞密度至1×10⁶ cells/mL。

2.接种：将细胞悬液接种至6孔板（84011ES），每孔2 mL；

3.PMA诱导：加入PMA（50601ES）至终浓度100 ng/mL（也可根据细胞状态调整为50 ng/mL），轻轻晃动混匀。

4.培养：置于37℃、5% CO2培养箱中培养24–48 h。倒置显微镜观察细胞形态（贴壁、呈不规则形、胞体增大为M0诱导成功标志）。

5.静息：吸弃含PMA的培养基，PBS轻轻润洗3次（彻底去除残留PMA），更换新鲜完全培养基（无PMA），继续培养48h使细胞静息，稳定M0状态。

二、M1型巨噬细胞极化诱导

1.极化培养基配制：在完全培养基中加入LPS（60747ES）（终浓度100 ng/mL）与IFN-γ（91207ES）（20ng/mL）。

2.刺激培养：吸弃M0细胞的静息培养基，每孔加入2mL M1极化培养基，继续培养24-48h。

三、M2型巨噬细胞极化诱导

1.极化培养基配制：在完全培养基中加入IL-4（90105ES）与IL-13（90112ES），终浓度均为20ng/mL。

2.刺激培养：吸弃M0细胞的静息培养基，每孔加入2mL M2极化培养基，继续培养48h（保障抗炎表型稳定表达，胞质丰富、伪足特征明显）。

四、极化效果验证

1.形态学观察（倒置显微镜，40×和100×）

M1型：细胞体积紧凑，呈阿米巴样或不规则圆形，短丝状伪足丰富，胞质内溶酶体密集（嗜碱性增强），具备强吞噬与运动能力。

M2型：细胞体积更大，呈扁平多角形或椭圆形，板状伪足发达，胞质透明（内质网/高尔基体丰富），伪足数量少于M1，侧重组织修复相关形态特征。

2. 表型标志物检测（流式细胞术）

a.细胞收集：吸弃培养基，PBS（41403ES）润洗后，用细胞刮（84508ES）轻轻刮取贴壁细胞，1200rpm离心5min，收集细胞沉淀。

b.抗体染色：用PBS重悬细胞至1×106 cells/mL，取100μL加入流式管，分别加入CD86-PE（772553ES）、CD206-FITC（32220ES）抗体及对应同型对照，4℃避光孵育30min。

c.检测分析：PBS（41403ES）洗涤2次，离心弃上清后用300μL PBS重悬，流式细胞仪检测。M1型以CD86+高表达为特征，M2型以CD206+高表达为特征。

3. 功能因子验证（可选）

M1型：ELISA检测上清中TNF-α（97072ES）、IL-6（97068ES）、iNOS含量，或qPCR检测TNF-α、iNOS基因表达（均显著上调）。

M2型：ELISA检测上清中IL-10（97063ES）、TGF-β含量，或qPCR检测IL-10、Arg-1基因表达（均显著上调）。

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佛波酯(PMA)：将THP-1单核细胞初步分化为未极化的M0型巨噬细胞

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