应用案例小鼠原代海马神经元提取与培养实验方案
小鼠海马神经元原代培养是研究神经元发育、轴突与树突形态、突触功能及其他多种神经元特性的重要体外模型。本文详细阐述了从小鼠胚胎海马组织（E17.5/E18.5）制备原代神经元的分步操作流程。本方案涵盖神经元培养体系制备、培养及鉴定的全部关键步骤，采用本方案获得的海马神经元，可根据不同实验目的接种于各类细胞培养皿，且可在一周内获得纯度高、分化成熟、性能稳定的神经
小鼠海马神经元原代培养是研究神经元发育、轴突与树突形态、突触功能及其他多种神经元特性的重要体外模型。本文详细阐述了从小鼠胚胎海马组织（E17.5/E18.5）制备原代神经元的分步操作流程。本方案涵盖神经元培养体系制备、培养及鉴定的全部关键步骤，采用本方案获得的海马神经元，可根据不同实验目的接种于各类细胞培养皿，且可在一周内获得纯度高、分化成熟、性能稳定的神经元。
①在无菌超净台中，用无菌PBS（41403ES）或细胞培养注射水（60167ES）等无菌水将多聚-D-赖氨酸（60715ES）配制成浓度为0.1 mg/mL的溶液后通过0.22 μm过滤器（84309ES）过滤，或者直接使用翌圣生物0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液（60714ES）。
②向培养皿/板中加入适量的0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液，轻轻摇晃，使其均匀覆盖在培养器皿表面。
③室温孵育10~20 min后，用移液器吸出溶液，再用无菌PBS（41403ES）或细胞培养注射水（60167ES）等无菌水清洗2次。
④干燥1~2 h后，即可进行细胞培养。
①将12 mm普通盖玻片放入24孔板中，加入0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液（60714ES）溶液覆盖，孵育20min
②用PBS（41403ES）清洗2次
③加入用无菌PBS（41403ES）稀释的10 µg/mL的Laminin Mouse Protein，37°C孵育至少4h
④在接种细胞前，用无菌PBS（41403ES）再冲洗2次，以防表面干燥
①对妊娠小鼠实施安乐死，可采用CO2安乐死或使用异氟烷（716882ES）麻醉后进行断头或颈椎脱臼处理。
②将小鼠固定在干净的操作区域，并用70%乙醇对腹部进行消毒。
③使用如图1A所示的手术剪，沿小鼠腹部正中线切开腹部，切口从耻骨区域开始，向上一直延伸至腹腔末端，具体位置如图2A中虚线所示。
注：使用手术剪切开时，使用如图1B所示的镊子夹起并提拉小鼠的皮肤层，这样可以避免误伤位于其正下方的胚胎。
图1.用于海马神经元制备的解剖器械
A.手术剪B.有齿直镊C.精细剪D.解剖弯镊E.精细弯镊
图2.E17.5/E18.5胚胎分离
A.固定后的妊娠小鼠，白色虚线表示步骤2③中腹部切口的位置；B.腹部切开后暴露出的子宫
④使用如图1A-1B的手术剪和有齿直镊，小心地剥离并完全暴露包含胚胎的完整子宫(子宫角)(如图2B所示)，随后立即将子宫转移到含有预冷PBS的100 mm培养皿中(如图3A所示)。
注意:用镊子抓住子宫并将其拉出腹部，另一只手用手术剪刀剪断任何粘附物和子宫颈连接(如图2B箭头所示)
⑤继续使用镊子和手术剪分离获得单个胚胎，小心去除胎盘及卵黄囊。随后将胚胎转移至新的100 mm培养皿（84003ES）中，培养皿内含预冷的PBS，充分清洗胚胎以去除表面的血液及胚胎液（如图3B所示）。
⑥使用如图1B所示的镊子固定胚胎，并使用手术剪剪下头部（如图3C所示）。随后将胚胎头部转移至新的100 mm培养皿（84003ES）中，培养皿内含有预冷的DMEM完全培养基（含10%胎牛血清40132ES和1%双抗60162ES的DMEM高糖培养基41401ES）。
注：图3A、图4、图5和图6为了获得更清晰的成像效果，使用PBS（41403ES）代替含酚红的培养基进行拍摄。
图3.从子宫中分离胚胎示意图。
A.分离后的子宫；B.分离出的小鼠胚胎；C.小鼠胚胎头部；D.胚胎头部侧视图。白色虚线表示步骤3①中横向切开的部位：使用手术剪（黑色剪刀处）从颅骨后部进行切割，同时用镊子夹持胚胎鼻部区域（黑色箭头所示）。
①在无菌超净台中，准备内含预冷的DMEM完全培养基（含10%胎牛血清40132ES和1%双抗60162ES的DMEM高糖培养基41401ES）的100 mm的培养皿（84003ES）用于脑解剖。依次取单个胚胎头部置于上述培养基中，轻轻地将脑从胚胎头部分离出来(如图4A所示)。
a.一只手使用如图1B所示的镊子捏住头部的口/鼻区域(如图3D中的黑色箭头所示)。另一只手使用如图1C所示的精细剪从颅骨后部(如图3D中黑剪刀位置)沿着图3D中白色虚线剪开。
b.将胚胎头倒置，露出脑基底区，使用两个有齿直镊(如图1B所示)轻轻拉开颅骨，小心地取出整个脑组织(图4A)，转移并收集到一个新的100 mm培养皿（84003ES）中，培养皿中含有新鲜预冷的DMEM完全培养基。
注：每完成一个脑组织的分离后，均需更换培养基，以避免血液污染。
②每次取一个脑组织，转移至装有预冷完全DMEM培养基的35 mm培养皿盖（84001ES）中，并置于体视解剖显微镜下进行操作。
注：与35 mm培养皿相比，培养皿盖的深度更浅，更有利于灵活操作与精细移动。
a.使用两把解剖弯镊（如图1D所示），一把镊子夹持脑组织侧面（如图4A中的白点所示），另一把镊子沿脑中线插入（如图4A虚线所示），将左右大脑半球分离。随后继续使用弯镊轻轻将两侧脑半球向外分开并翻转，以充分暴露并观察海马区域（如图4B–4C）。
注：胚胎脑部十分脆弱，夹取和解剖时，动作需轻柔。
图4.海马体定位示意图
A.已解剖出的胚胎脑组织。白色虚线表示使用一把弯镊沿脑中线分离左右脑半球的位置，同时另一把弯镊夹持脑组织侧面（白点所示）。B.分离后的左右脑半球。白色箭头所示为各脑半球中的海马体区域位置。C.单侧脑半球海马体区域的高倍图像，白色虚线标示海马区域范围。
④使用两把精细弯镊（如图1E所示）将每个脑半球脑膜切除(如图5所示)。一只手用镊子固定整个脑组织，另一只手把镊子用于轻柔剥离脑膜。建议从嗅球区域开始夹持脑膜，并逐渐向后牵拉，以尽可能完整地去除脑膜。
注：在此过程中，应轻柔固定脑组织，并根据脑膜剥离的难易程度，多次调整夹持位置。
充分去除脑膜，可最大程度降低神经元培养体系中的非神经元细胞污染。
图5.切除脑膜示意图
箭头所指为海马体、皮质区域、嗅球以及被切除的脑膜
⑤继续使用精细弯镊（如图1E所示）沿海马边缘进行精细分离，直至将整个海马区域完全分离（如图5–6所示）。随后使用弯镊轻轻夹取每个海马体，并转移至新的35 mm培养皿中，培养皿需含2 mL预冷的含1%双抗（60162ES）无血清DMEM培养基（41401ES），并始终置于冰上保存。
注：海马体可通过其典型的“C”形解剖结构，以及在体视显微镜下相较于相连皮层区域不同的折光特性进行辨认区分（如图5–6所示）。
①使用两把精细弯镊（如图1E所示）在35 mm培养皿（84001ES）中对海马体进行剪碎。该培养皿中应含有用于收集海马的2 mL预冷无血清DMEM培养基(41401ES)。将每个海马体剪为较小组织块（每个海马剪成约5–6块，每块体积约为2–3 mm³，如图6C所示）。
注：在步骤3⑤和4①中，海马组织必须收集并保存于无血清DMEM培养基中，以避免在步骤4②中抑制胰蛋白酶活性。
②在无菌超净台中，使用移液器将含有剪碎海马组织的培养液转移至50 mL无菌离心管(83507ES)中。随后向海马组织中缓慢加入2 mL 0.25% Trypsin-EDTA（40127ES），并将离心管置于37°C水浴中消化25 min（最终胰酶浓度为0.125%）。
注：在25 min的胰酶消化过程中，剪碎的海马组织块会自然沉降至50 mL离心管底部。
③准备一个15 mL无菌离心管(83505ES)，内含2 mL预温至37°C的DMEM完全培养基（含10%胎牛血清和1%双抗）。
④消化结束后，小心将50 mL消化离心管重新转移至超净台中，注意不要扰动或重新悬浮已经沉降的海马组织。随后使用带1 mL枪头的移液器（84707ES），仅吸取海马体沉淀，并转移至含有2 mL完全培养基的15 mL离心管中。
注：使用1 mL枪头时，应直接接触50 mL离心管底部的海马体沉淀。轻柔吸取并仅转移底部海马组织，尽量避免带入过多消化液。
吹打分散海马体组织
①使用本生灯对无菌玻璃巴斯德吸管进行烧制，以形成更更光滑的吸管尖端(如图7所示)。使用图7B所示的烧制的吸管，对海马体组织块进行缓慢且轻柔的吹打混匀，上下吹打6~8次。
注：吹打分散步骤是影响海马体神经元细胞得率和活性的关键步骤，在对玻璃吸管进行烧制抛光后，务必待吸管充分冷却后再用于吹打分散。
②再次使用本生灯烧制一支玻璃巴斯德吸管，使其形成更细长且逐渐变尖的吸管尖端（如图7C所示）。使用该吸管对海马细胞悬液缓慢进行一次上下吹打，以释放单个细胞。获得单细胞悬液后，应立即进入步骤6。在细胞计数期间，应将单细胞悬液置于具有无菌超净台内，并保持室温。
注：若使用图7C所示细长尖端的烧制拉细吸管进行反复多次吹打，会造成细胞损伤并降低细胞活率。
图7. 玻璃巴斯德吸管尖端
A.未处理的玻璃巴斯德吸管尖端；B.经烧制抛光后的玻璃巴斯德吸管，具有更光滑且较小的尖端；C.经烧制拉细后的玻璃巴斯德吸管，具有细长且超小的锥形尖端。
①取50 μL细胞悬液，加入5 μL台盼蓝染液（40207ES）以检测细胞活率。使用细胞计数仪进行细胞计数。
注：细胞活率通常在70–90%之间。以8个胚胎来源的神经元制备为例：总细胞数约为5×10⁶；活细胞数约为4×10⁶；细胞活率约为80%。
②其余海马体细胞悬液以350× g离心5 min。弃上清后，添加适量预温的Neuronal-Basal神经元细胞基础完全培养基，轻柔地上下吹打。细胞沉淀重悬后，将细胞接种于预先经过多聚-D-赖氨酸包被的细胞培养皿或培养板中，推荐接种密度约为2.6×105 cells/cm²。
注：a.神经元细胞完全培养基的配制方法：向500 mL Neuronal-Basal神经元细胞基础培养基（不含L-谷氨酰胺）(41410ES)中加入：10 mL 50X B27添加剂（60703ES）和5 mL 100× 双抗（60162ES）
b.每个胚胎通常可获得约4×105–6×105个细胞。
③在初次接种后18–24 h，向培养体系中加入阿糖胞苷（54115ES），以抑制增殖细胞（即非神经元细胞）的分裂。具体方法为：移除50%体积的神经元细胞完全培养基，并补加等体积且含2 µM Ara-C（54115ES）的新鲜培养基，使培养体系中Ara-C最终浓度为1 µM。
④原代海马神经元培养过程中，每48–72 h需更换50%培养基。首次Ara-C处理后，后续换液时无需继续添加Ara-C。
⑤培养6天后，原代神经元通常已发育成熟并完成较好的分化，其状态可通过细胞形态学特征以及典型神经元标志物的表达进行评估，包括：Tubulin-β-III（769653ES）、NeuN（31082ES）、Rbfox1（762836ES）、神经营养因子受体TrkB（769934ES、）以及多种其他神经元相关蛋白GFAP（772986ES）、Rbfox1（762835ES）、Rbfox2（38767ES）[1]（如图8和图9所示）。
图8.培养过程中神经元的发育与分化
A.原代海马神经元在体外培养第1天至第6天的明场显微图像。可观察到随着培养时间延长，神经元网络复杂性逐渐增加（20×）。B.体外培养6天后海马神经元的Western blot分析。采用针对分化神经元标志物的抗体进行免疫印迹检测，包括：BDNF受体TrkB胞外结构域（用于检测所有TrkB亚型）；Rbfox1；β-III-tubulin（b-III-Tub）；Rbfox3（NeuN）。分子量标准（Molecular Weight markers）标示于图左侧。
神经细胞特异性标志物及其抗体产品指南详见官网：神经元基础培养基：解锁神经科学的“生命营养液”
①培养6天后，弃去24孔板中培养基，PBS清洗后，用4%多聚甲醛在4℃条件下固定30 min。
②使用PBS（41403ES）清洗细胞3次，每次5 min。
③室温下使用封闭液封闭1 h。封闭液配制方法如下：10% normal donkey serum（v/v）（36136ES）;0.1% Triton X-100（v/v）（36317ES）;0.1% BSA（w/v）（36100ES）以上组分均使用PBS（41403ES）配制。
④加入特异性一抗，于4℃孵育过夜。
注：一抗稀释液组成如下：1% normal donkey serum ;0.1% Triton X-100（v/v）（36317ES）;0.1% BSA（w/v）（36100ES）;PBS（41403ES）,抗体稀释比例：anti-GFAP抗体：1:1000;anti-Tubulin-β-III抗体：1:200
⑤使用PBS（41403ES）清洗3次，每次5 min。
⑥加入相应荧光二抗及终浓度0.5 µg/mL的DAPI（40727ES）进行细胞核染色，室温孵育2 h。
YSFluor™488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)（34206ES）用于GFAP抗体
YSFluor™647 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)（34113ES）用于Tubulin-β-III抗体
二抗按1:250比例稀释，稀释液与④相同。
⑦使用PBS清洗（41403ES）3次，每次5 min。
⑧将盖玻片翻转后，使用荧光封片剂(36307ES)封片于载玻片上。待封片剂干燥后，可进行共聚焦显微镜成像分析。
图9.培养6天后原代海马神经元的免疫荧光染色结果
神经元分别在添加（A–D）或未添加（E–H）阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C，1 µM）的条件下培养，并进行了以下标志物染色：胶质细胞标志物GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein，绿色）；神经元标志物β-III-tubulin（b-III-TUB，红色）；细胞核染料DAPI（蓝色）。可见在未进行Ara-C处理的神经元培养体系中（F），培养6天后存在大量GFAP阳性细胞。I–K为添加1 µM Ara-C培养条件下神经元的高倍图像，细胞分别染色：β-III-tubulin（b-III-TUB，绿色）；DAPI（蓝色）。图中可见培养6天后形成较为复杂的神经元网络结构。
①Fluo-4上样缓冲液的配制：配制1 mL上样缓冲液时，向10 µL PowerLoad（100×）中加入1 µl Fluo-4储备液（Fluo-4储备液浓度为1 mM，溶于DMSO（60313ES）；最终工作浓度为1 µM），随后加入10 µL Probenecid（储备液250 mM；终浓度2.5 mM）和979 µL ECS缓冲液。
注：ECS缓冲液组成为140 mM NaCl（730341ES）；4.7 mM KCl（726332ES）；2 mM NaHCO3（730324ES）；1 mM NaH2PO4（702972ES）；1.2 mM MgCl2（719462ES）；1.5 mM CaCl2（706203ES）；3 mM glucose（54927ES）；10 mM HEPES（60114ES），pH调节至7.4
②在体外培养6天后，弃
去24孔板（84013ES）中培养基后，每个盖玻片加入250 µL Fluo-4上样缓冲液，于37℃孵育30 min。随后用37℃ ECS缓冲液洗涤30 min，以促进Fluo-4的去酯化及活化。
③将记录灌流槽内的灌流速度调整为0.5 mL/min，并将温度设定为37°C。
④将盖玻片置于记录灌流槽内，并选择合适的观察视野。
⑤调节焦距，将480 nm激光强度调至尽可能低的水平，并设置积分时间（像素驻留时间），使采集时间短于500 ms，使单帧采集时间短于500 ms。随后在共聚焦显微镜上以2帧/秒的速度进行时间序列采集。
⑥记录神经元自发活动，随后加入1 mM谷氨酸(709662ES)处理10 s，以诱导细胞去极化并显示视野中的全部细胞。
⑦
a.将图像文件导入ImageJ；
b.将查找表（lookup table）设置为Rainbow RGB；
c.调整图像亮度与对比度；
d.打开ROI manager（Analyze/Tools/ROI manager）；
e.选择适当的ROI区域形状覆盖目标神经元；
f.选择Images/Stacks/Plot Z-axis Profile，以绘制所选ROI随时间变化的荧光强度曲线
g.将ROI添加至ROI manager，并继续分析其他ROI区域。所得荧光强度曲线可导出至电子表格中，用于后续定量分析。
图10.体外培养6天后原代海马神经元的钙成像结果
A.加载钙离子荧光探针Fluo-4的原代海马神经元，其单个神经元随时间变化的钙荧光强度曲线。可观察到在加入1 mM谷氨酸处理前（蓝色横条所示），神经元已存在自发性活动。B.图A中所分析的单个神经元在图像中的对应编号位置。C.神经元培养体系在加入1 mM谷氨酸刺激前的代表性钙荧光图像。D.神经元培养体系在加入1 mM谷氨酸刺激后的代表性钙荧光图像。
视频1.体外培养6天后原代海马神经元的实时钙成像
小鼠原代海马神经元提取和培养相关试剂总汇
分类 | 产品货号 | 产品名称 |
细胞类 | Neuronal-Basal Medium（no L-Glutamine）神经元细胞基础培养基（不含L-谷氨酰胺） | |
DMEM High Glucose Medium DMEM高糖培养基（含L-谷氨酰胺，丙酮酸钠110 mg/L；不含HEPES，双抗） | ||
Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清（特级） | ||
Penicillin-Streptomycin (100×), Suitable for Cell Culture 细胞培养用青霉素-链霉素（双抗） | ||
PerfCell™ Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red 胰酶-EDTA溶液（0.25%），含酚红 | ||
NSC-27 supplement, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂，等同于B-27 | ||
Poly-D-Lysine Solution 多聚-D-赖氨酸溶液（0.1 mg/mL） | ||
0.4% Trypan Blue Solution 台盼蓝染色液（0.4%） | ||
Fluo-4, AM, Cell Permeant 细胞膜可渗透钙离子荧光探针 | ||
生化试剂 | 10× TBST缓冲液 | |
Tween-20 吐温-20 | ||
DAPI 4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐 | ||
4%多聚甲醛固定液 | ||
Distilled Water 蒸馏水 | ||
1× D-PBS，不含钙、镁离子 | ||
1× PBS细胞培养级 | ||
DMSO 二甲基亚砜（细胞培养级） | ||
/ | 70% Ethanol solution 70% 乙醇溶液 | |
蛋白类 | Precast Protein Plus Gel, 4-12%, 10 wells, Bis-Tris 4-12%高分辨率预制胶(Bis-Tris)，10孔 | |
Precast Protein Plus Gel, 4-12%, 15 wells, Bis-Tris 4-12%高分辨率预制胶(Bis-Tris)，15孔 | ||
SuperSignal SuperDura Extended Duration Substrate持久性化学发光底物 | ||
Immunostaining Permeabilization Buffer with Triton X-100 免疫染色通透液（Triton X-100） | ||
5× SDS-PAGE Protein Loading Buffer 5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 | ||
Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂（水溶性） | ||
Bovine Serum Albumin(BSA), PCR Grade 牛血清白蛋白 | ||
Normal Donkey Serum 封闭用驴血清（原液） | ||
Skim Milk 脱脂奶粉 | ||
0.45 μm PVDF Membrane（1 roll, 30 cm x 3.75 m） 0.45 μm PVDF 膜（1 卷, 30 cm x 3.75 m） | ||
/ | Laminin Mouse Protein小鼠层粘连蛋白 | |
抗体类 | beta III Tubulin (3H2) Mouse mAb | |
GFAP Rabbit pAb | ||
TrkB Mouse mAb | ||
YSFluor™488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | ||
YSFluor™ 647 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | ||
/ | Anti-Fox1 mouse mAb, clone 1D10 | |
Anti-Rbfox3 (NeuN) mouse mAb | ||
小分子化合物 | Poly-D-lysine 多聚-D-赖氨酸（分子量:150000-300000） | |
Probenecid sodium 丙磺舒纳 | ||
Cytarabine hydrochloride盐酸阿糖胞苷 | ||
Isoflurane 异氟烷 | ||
Sodium chloride, for cell culture 氯化钠,用于细胞培养 | ||
Potassium chloride, for cell culture 氯化钾,用于细胞培养 | ||
Sodium bicarbonate, for cell culture 碳酸氢钠, 用于细胞培养 | ||
Anhydrous sodium dihydrogen phosphate, for cell culture 无水磷酸二氢钠, 用于细胞培养 | ||
Magnesium chloride hexahydrate, for cell culture 六水合氯化镁, 用于细胞培养 | ||
Calcium chloride anhydrous, for cell culture 无水氯化钙, 用于细胞培养 | ||
Dextrose (D-glucose)D-葡萄糖, 用于细胞培养 | ||
HEPES Sodium Salt, Cell Culture Grade HEPES钠盐， 细胞培养级 | ||
D-Glutamic acid D-谷氨酸 | ||
耗材类 | 24孔细胞培养板（TC处理) | |
35 mm细胞培养皿（TC处理） | ||
100 mm细胞培养皿（TC处理） | ||
15 mL离心管灭菌袋装 | ||
50mL离心管灭菌袋装 | ||
细胞计数板/血球计数板，玻璃 | ||
针头式过滤器，0.22 µm，PES，25 mm，灭菌 |
小鼠海马神经元是研究神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）相关的神经毒性和氧化应激机制的理想模型。
①神经损伤体外模型
a.造模方法：用5 mmol/L-谷氨酸(710424ES)处理24h[2]或20 μmol /L Aβ1-42(50057ES)处理24h[3]
b.形态学检测：显微镜观察突出抽数目和长度变化和胞体面积变化等情况；
c.功能学检测：CCK8法(40203ES)和MTT法(40206ES)检测细胞存活率、ELISA法检测乳酸脱氢酶LDH活性(40209ES)、DCFH-DA探针检测胞内活性氧（ROS）水平(50101ES)；
d.分子水平检测：Western blot检测抗氧化蛋白（如SOD1、GPX4）、凋亡相关蛋白（如Caspase-3、Caspase-9）、神经突触指标(SYP、MAP-2)等表达
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Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8试剂盒 | ||
MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 | ||
LDH Cytotoxicity Assay Kit 乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒 | ||
Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒 | ||
2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate DCFH2-DA | ||
抗体类 | Superoxide Dismutase 1 Recombinant Rabbit mAb [KD验证] | |
Glutathione Peroxidase 4 Recombinant Rabbit mAb [KD验证] | ||
Caspase 3 Rabbit pAb [KD验证] | ||
Caspase 9 Mouse mAb | ||
Synaptophysin (10C8) Mouse mAb | ||
MAP2 (3B5) Mouse mAb | ||
小分子化合物 | DL-Glutamic acid DL-谷氨酸 | |
β-Amyloid (1-42), (rat/mouse) |
②突触结构与功能相关研究
a.处理方案：添加脑源性神经营养因子（BDNF，5-25ng/mL）（92129ES）处理细胞，可促进突触发生发育[4]，处理时间视实验目的而定，通常24小时-3天不等；
b.免疫荧光染色检测：用突触前标志物Synaptophysin（772628ES）和突触后标志物PSD-95（764240ES）共染，激光共聚焦显微镜观察突触数量；
c.树突棘密度与形态分析:DiI标记（40757ES）和GFP转染（40801ES）后使用激光共聚焦显微镜，对树突棘和丝状伪足进行精准定量与形态观察；
d.树突生长测定：用抗MAP2抗体（38986ES）标记树突，DAPI染核(40728ES)，计数每个神经元的初级树突数量。
更多小鼠海马神经元转染案例详见官网：HT22小鼠海马神经元细胞DNA转染案例
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HiActi® Recombinant Human/Mouse/Rat BDNF Protein 重组人/小鼠/大鼠脑源性神经营养因子 | ||
DiR Iodide (DiIC18(7)) 细胞膜深红色荧光探针 | ||
DiD Perchlorate (DiIC18(5)) 细胞膜红色荧光探针 | ||
DAPI Solution DAPI染液（5 mg/mL） | ||
Hieff Trans® LipoBooster 3000 Transfection Reagent Lipo3000转染试剂 | ||
抗体类 | Synaptophysin Mouse mAb（IHC专用） | |
PSD95 Rabbit pAb | ||
MAP2 (3B5) Mouse mAb |
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疾病分类 | 产品名称 | 作用位置 | 作用原理 |
多发性硬化症 | 中枢神经系统（体感皮层、脊髓、杏仁核、小脑等），神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞 | ①外周来源的TNF-α诱导体感皮层突触后树突棘和突触前轴突终末周转增加，破坏突触结构；②神经元自身产生的TNF-α增加皮层神经元钙信号频率、自发神经元活动，引发皮层过度兴奋和焦虑样行为；③结合TNFR1促进突触功能障碍，结合TNFR2则有相反作用；④早期通过稳态缩放发挥代偿作用，后期引发兴奋性毒性和神经元死亡。 | |
中枢神经系统，神经元、轴突 | 通过调节F-肌动蛋白细胞骨架，保护轴突并促进轴突生长，间接保护突触，维持突触功能。 | ||
中枢神经系统，皮层神经元 | 与TNF-α协同作用，诱导局灶性皮层损伤，使损伤邻近的皮层神经元沉默，引发突触功能障碍。 | ||
阿尔茨海默病 | 中枢神经系统（海马体、皮层），小胶质细胞、神经元 | ①IFN-I刺激小胶质细胞介导的突触丢失，引发记忆障碍；②IFN-γ由T细胞产生，诱导小胶质细胞介导的突触清除，导致学习能力受损；阻断IFN-γ受体或敲除小胶质细胞的IFNAR可减少突触丢失、小胶质细胞活化和学习障碍。 | |
中枢神经系统（海马体、皮层），神经元、小胶质细胞 | 在AD病理出现前，即可降低抑制性GABA能神经传递，同时增加兴奋性谷氨酸能神经传递，打破突触兴奋-抑制平衡，引发突触功能障碍，最终导致神经元过度兴奋和损伤。 | ||
中枢神经系统（脑膜、脑实质），谷氨酸能神经元、小胶质细胞 | 由脑膜γδ17 T细胞产生，通过结合IL-17Ra，抑制谷氨酸能神经传递、短期记忆和长时程增强（LTP），引发突触功能障碍和认知衰退；在雌性AD转基因小鼠中，γδ17 T细胞在脑和脑膜中积累，是突触功能障碍和认知下降的核心诱因。 | ||
神经发育障碍 | 胚胎期中枢神经系统、成年后体感皮层/海马体，谷氨酸能神经元 | 母体T辅助17细胞产生的IL-17A，通过胎盘作用于胚胎期神经元，引发子代皮层结构异常、社交能力缺陷等ASD/SZ样行为；成年后，IL-17A通过结合体感皮层谷氨酸能神经元的IL-17Ra，调控社交和焦虑样行为，作用效果因释放时机、脑区、浓度不同而有差异。 | |
胚胎期中枢神经系统（海马体），神经元 | 母体来源的IL-6通过胎盘进入胚胎，结合神经元上的IL-6R-β/gp130受体，启动突触形成相关的转录程序，导致胚胎海马体谷氨酸能突触的结构和功能异常升高，成年后子代出现脑回路过度连接、ASD/SZ样行为缺陷。 | ||
胚胎期中枢神经系统、成年后腹侧海马体，神经元、小胶质细胞 | 母体来源的TNF-α可影响子宫内脑回路发育，导致子代先天恐惧行为异常；成年后，应激状态下小胶质细胞释放的TNF-α升高，诱导海马体AMPAR电流增加，维持应激引发的突触变化和焦虑行为。 | ||
癫痫 | 中枢神经系统（海马体、皮层），小胶质细胞、神经元 | ①小胶质细胞中TNF-α升高，增加癫痫易感性，可引发致死性癫痫发作；血脑屏障可渗透的TNF-α抑制剂可减轻癫痫发作；②直接注射入海马体时，TNF-α可抑制癫痫发作，其双向作用由结合的受体决定：TNFR1促进癫痫发作，TNFR2抑制癫痫发作；③ 可通过调控电压门控钠通道（Nav1.3、Nav1.8）转录，改变神经元兴奋性，影响癫痫发作。 | |
中枢神经系统（海马体），谷氨酸能神经元 | 结合IL-1R1受体，与NMDAR的NR2B亚基结合，促进NR2B磷酸化，增加NMDAR介导的Ca²⁺内流，增强神经元兴奋性，引发海马体神经元过度兴奋，促进癫痫发作；阻断IL-1R1可抑制神经元过度兴奋，减轻癫痫发作。 | ||
中枢神经系统（海马体），神经元 | 与IL-1β作用相反，IL-18缺乏会增强基础神经传递、增加突触数量，加剧癫痫发作；IL-18可通过调控突触功能，维持神经元兴奋-抑制平衡，抑制癫痫发作。 | ||
可卡因和吗啡成瘾 | 中枢神经系统（纹状体、外侧缰核），神经元、小胶质细胞 | ①可卡因反复给药后，纹状体小胶质细胞释放TNF-α，驱动突触后膜AMPAR内吞，降低突触强度，限制行为敏化的发展，对可卡因成瘾产生适应性保护作用；②吗啡戒断期，外侧缰核内TNF-α显著升高，伴随谷氨酸能神经传递降低，调控突触可塑性和吗啡相关的行为适应，介导戒断引发的厌恶情绪。 | |
神经性疼痛 | 中枢神经系统（脊髓、海马体），小胶质细胞、神经元 | 小胶质细胞产生的TNF-α，调控脊髓和海马体神经元回路的突触传递，介导疼痛相关的突触可塑性变化，是神经性疼痛的核心调控因子；细胞内蛋白酶CASP6可通过促进小胶质细胞释放TNF-α，直接调控脊髓突触传递和炎症性疼痛。 |
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HiActi®细胞因子选购指南
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类器官培养案例 |
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多能干细胞 胚胎干细胞 诱导多能干细胞 | |
专能干细胞 神经干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 | IL-3/SCF/FLT3L：赋能HSPC体外高效扩增的核心驱动体系 |
培养用细胞因子 |
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先天性免疫细胞 吞噬细胞 树突状细胞 自然杀伤细胞 嗜酸/碱性粒细胞 | 小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）培养方法及细胞因子的选择 |
适应性免疫细胞 T细胞 B细胞 |
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参考文献
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[2] 吕彩珍, 吴燕川, 孔玲, 等.HT22、SY5Y细胞在L-谷氨酸损伤模型中的应用[J].神经疾病与精神卫生2022,22(4):269-274. DOI:10.3969/j.issn.1009-6574.2022.04.008.
[3] 王昱驰, 马宏玉, 王振宇, 等.Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病细胞模型中神经损伤及凋亡的机制[J].山西医科大学学报,2024,55(2):175-183.DOI: 10.13753/j.issn.1007-6611.2024.02.007.
[4] Yuanyuan Ji, Petti T Pang, Linyin Feng,et al.Cyclic AMP controls BDNF-induced TrkB phosphorylation and dendritic spine formation in mature hippocampal neurons[J].Nature Neuroscience, 2025, 8(2):164-172.DOI: 10.1038/nn1381
[5] Akira Yoshii, Martha Constantine-Paton. BDNF induces transport of PSD-95 to dendrites through PI3K-AKT signaling after NMDA receptor activation[J].Nature Neuroscience, 2007, 10(6):702-711.DOI:10.1038/nn1903
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