应用方向精品推荐|合成DNA片段，何不选用快且准确的方式?
高保真DNA聚合酶相比于Taq DNA 聚合酶有所不同，两者最大的区别在于前者具有强校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。当出现错配的核苷酸时，DNA合成会因为错误的匹配而暂时停止，期间高保真DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并使用正确的核苷酸进行替换。
给各位小伙伴们推荐精品之前，小翌先给大家出一道最近小翌碰到的问题╰(*°▽°*)╯
问：已知Taq DNA酶的最适变性和退火时间为30秒，最适延伸速度是60秒/kb，推荐循环数为35个循环，在克隆实验中小翌合成5 kb长的DNA片段理论上需要多久呢？
A． 理论上大概要3个小时左右
B． 理论上大概要4个小时左右
C． 理论上大概要5个小时左右
D． 理论上3分钟，安排师弟做(￫ܫ￩)
答案
B：预变性5 min+(变性30s+退火30s+延伸5min)×35+终延伸10min=225min
实际上小翌用这类Taq DNA酶合成5 kb的片段时，都不止4个小时，PCR仪器本身还有自己的升降温时间。试想一下，合成5 kb大小的DNA片段加上电泳验证，小翌要花一个下午才能确认(。_。)。除此之外，还有个潜在的风险，那就是辛辛苦苦花一下午合成的片段大小对了，序列不对，有部分碱基突变！
为避免这种情况的发生，最好的办法是用一个能又快又好合成DNA片段的DNA合成酶(安排小翌的师弟做)。目前出现了不少合成速度快的高保真酶，那高保真酶究竟是什么呢？
高保真DNA聚合酶相比于Taq DNA 聚合酶有所不同，两者最大的区别在于前者具有强校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。当出现错配的核苷酸时，DNA合成会因为错误的匹配而暂时停止，期间高保真DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并使用正确的核苷酸进行替换。
衡量不同高保真DNA聚合酶校正功能的指标是保真度，保真度通常用错配率的倒数表示(保真度=1/错配率)，指的是发生错配的核苷酸数量与合成的总核苷酸数的比值，错配率越低则表示保真度越好。
DNA聚合酶保真度的检测方法多种多样，例如蓝白班筛选鉴定、一代测序和二代测序等，使用不同的检测方法结果也会不一样。
检测方法 | 检测原理 | 优缺点 |
蓝白斑筛选 | 利用DNA聚合酶扩增lacZ基因，它可以还原β-半乳糖苷酶基因活性并产生蓝色菌落，结合蓝白斑筛选的结果可以评估保真度。 | 优点：快速、相对简单、经济有效；缺点：精确度不高，无法区分DNA的同义突变； |
一代测序 | 将PCR扩产物克隆至相应的载体中，通过对转化后的单菌落进行一代测序，对测序结果中错配的核苷酸数进行分析其保真度。 | 优点：精确度高；缺点：工作量大，整体成本相对较高； |
二代测序 | 使用NGS平台，将PCR扩增后的经相应处理后的文库产物进行测序分析，从而计算DNA聚合酶扩增过程中的保真度。 | 优点：精确度高；缺点：读长受限相对较大； |
2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix
高保真好：低错配率，高GC易突变序列中碱基错配比231/300000
扩增速度快：延伸速度快至5 sec/kb，省时高效
适用性广：可覆盖20-80%GC含量的基因，耐受小鼠裂解物和20%的血液
稳定性好：37℃下存放7天，不影响产品性能
快速简便：只需加入引物和模板即可进行扩增，带有上样染料，可直接电泳
以不同物种基因组为模板，选取6段GC rich、极易发生碱基突变/丢失的片段进行扩增，将各自PCR产物克隆至载体，并对每种序列挑取100个单克隆进行测序以确认碱基序列错配/突变情况。结果显示10164ES发生碱基错配/突变的比例优于国内外品牌试剂。
使用10164ES和不同产品均以5 sec/kb的延伸速度从100 ng人基因组模板扩增不同长度片段（0.4-10 kb），延伸时间均要求为5 sec/kb。结果显示，10164ES在10kb以内的片段均可以5 sec/kb的延伸速度扩增。Marker: Yeasen 10510ES。
使用10164ES从人gDNA模板中扩增23-76% GC含量片段，延伸时间设置5 sec/kb。结果显示，产品扩增特异性良好，能兼容不同GC含量片段扩增。Marker: Yeasen 10510ES。
可兼容不同类型的模板
使用10164ES从不同样本中扩增不同长度片段，延伸时间设置5-10 sec/kb。结果显示本产品扩增特异性良好，能兼容不同模板的不同片段扩增。
图解：1.小鼠gDNA 1 kb；2.小鼠gDNA 2 kb；3.小鼠gDNA 6 kb；4.玉米gDNA 1 kb；5.水稻gDNA 2 kb-A；6.水稻gDNA 2 kb-B；7.人293细胞cDNA 1 kb；8.人293细胞cDNA 2 kb ；9.人293细胞cDNA 3 kb；10.人293细胞cDNA 12 kb；11.大肠杆菌菌液8 kb；12.大肠杆菌菌液16 kb；13.水稻gDNA 10 kb-A；14.水稻gDNA 10 kb-B；15.水稻gDNA 10 kb-C；16.水稻gDNA 20 kb-A；17.水稻gDNA 20 kb-B；18.人血液直扩3 kb。Marker: Yeasen 10510ES。
动物gDNA-120bp-50%GC
客户评价：PCR过程速度快，条带合适，可在琼脂糖电泳中直接上样。进口N品牌的条带偏上，可能是自身的buffer影响，且未添加loading buffer，该产品可替代目前我的实验方案中的高保真酶。
客户评价：与进口T品牌相比，克隆条带更加清晰单一，整个PCR时间也更快，跑胶时不用再额外加染料，非常方便快捷。
客户评价：与国产V品牌相比，效果相当，个人感觉更佳。
客户评价：效果很好，条带清楚。回到开头的问题，若小翌使用这款5秒/kb的快速高保真PCR Mix扩增5 kb的DNA片段用于克隆，理论上大概需要多久？
答案是~
预变性30s+(变性10s+退火5s+延伸25s)×35+终延伸2min=25min50s<<225min ᕙ(`▿´)ᕗ 省时间的同时还减少了错配情况的发生!
产品定位 | 产品名称 | 货号 | 规格 |
TA/平末端通用高效拓扑克隆 | Hieff Clone®Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 20 T | |
平末端拓扑克隆 | Hieff Clone®Zero TOPO-Blunt Cloning Kit | 20 T | |
平末端拓扑克隆，不含多克隆位点 | Hieff Clone®Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit | 20 T | |
单片段同源重组克隆 | Hieff Clone®Plus One Step Cloning Kit | 20/50 T | |
单多片段通用同源重组 | Hieff Clone®Universal One Step Cloning Kit | 20/50 T | |
常规克隆感受态 | TOP10 Chemically Competent Cell | 10×100μL | |
常规克隆感受态 | DH5α Chemically Competent Cell | 10×100 μL | |
快速克隆感受态 | DH5α Fast Chemically Competent Cell | 10×100 μL | |
常规克隆感受态 | BL21(DE3) Chemically Competent Cell | 10×100 μL | |
快速PCR | 2×Hieff®Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 1/5×1 mL | |
常规条带分离 | Agarose琼脂糖 | 100 g | |
安全无毒核酸染料 | YeaRed Nucleic Acid Gel Stain(10,000× in Water) | 500 μL |
站内暂未收录 · 可询价 图 Hieff® Smearase/DNA 片段化模块
站内暂未收录 · 可询价 图 Hieff NGS® OnePot Pro Fragmentation Reag...
站内暂未收录 · 可询价 图 Hieff NGS® Fast-Pace DNA Fragmentation R...
站内暂未收录 · 可询价 图 Hieff NGS® DNA Fragmentation Reagent /快速...
站内暂未收录 · 可询价 图 Hieff NGS® C102P4 DNA Fragmentation Reag...
站内暂未收录 · 可询价 图 Hieff NGS ® OnePot EvoMax DNA Library Pr...
站内暂未收录 · 可询价