Case Studies干细胞&小分子化合物 | 前列腺素E2调控脊椎动物造血干细胞稳态研究案例解析

实验材料

• 斑马鱼品系：AB 野生型、Tg (cd41:GFP) 转基因品系（标记 HSC 和血小板）
• 试剂：PGE2、吲哚美辛(Cat#716547ES)（cox 抑制剂）、吗啉代寡核苷酸（MO）
• 仪器：体视荧光显微镜、流式细胞仪

实验步骤

1) 胚胎处理：收集受精后 12 小时（hpf）的斑马鱼胚胎，分别用不同浓度的PGE2(Cat#60810ES)（1-100 μM）或吲哚美辛(Cat#716547ES)（10 μM）处理。

2) 表型观察：在受精后 36 小时、48 小时、72 小时，通过体视荧光显微镜观察 Tg (cd41:GFP) 胚胎中 GFP 阳性细胞的数量和分布。

3) 流式细胞术定量：收集受精后 48 小时的胚胎，制备单细胞悬液，流式细胞术检测 CD41-GFP 阳性细胞比例。

4) 基因表达分析：收集不同处理组的胚胎，提取总 RNA，qRT-PCR 检测 HSC 标志物 runx1、c-myb 的表达水平。

实验结果

• 吲哚美辛处理组胚胎中 CD41-GFP 阳性细胞数量减少约 70%，runx1 和 c-myb 表达显著下调；
• 10 μM PGE2 处理组胚胎中 CD41-GFP 阳性细胞数量增加约 2 倍，runx1 和 c-myb 表达显著上调；
• PGE2 可逆转吲哚美辛对 HSC 发育的抑制作用。

图1 前列腺素通路调控斑马鱼胚胎造血干细胞发育。(a-e) 3 体节至 36hpf 用 PGE2、PGI2、cox1 抑制剂 SC560 或 cox2 抑制剂 NS398 处理胚胎，检测 HSC 中 runx1/cmyb 表达；(f-g) 36hpf 胚胎 cox2 原位杂交（反义 / 正义探针）；(h) 流式分选造血细胞群中 cox1 和 cox2 的相对表达；(i) 共聚焦显微镜定量各组 HSC 数量；(j-r) 36hpf 胚胎 runx1、cmyb 和髓过氧化物酶原位杂交；(s-d’) MO 敲低 cox1/cox2/PGE2 合酶 / EP2/EP4 后 runx1/cmyb 表达及 dmPGE2 拯救实验；(e’) CD41+ HSC 与 CD41 - 细胞中 EP2/EP4 的 qPCR 分析。来源：North TE et al. Nature, 2007, Supplementary Figure 1

实验材料

· 实验动物：8-10 周龄 C57BL/6 小鼠（CD45.2）、BoyJ 小鼠（CD45.1）

· 试剂：PGE2、DMSO、ACK 红细胞裂解液、CD117 磁珠

· 仪器：超净工作台、离心机、流式细胞仪

实验步骤

1) 骨髓细胞分离：颈椎脱臼处死 C57BL/6 小鼠，取出股骨和胫骨，用 PBS (Cat#41403ES)冲洗骨髓腔，制备单细胞悬液。

2) 红细胞裂解：加入 ACK 红细胞裂解液，室温孵育 5 分钟，PBS 洗涤 2 次。

3) c-Kit⁺细胞富集：使用 CD117 磁珠进行免疫磁分选，获得 c-Kit⁺造血干 / 祖细胞。

4) PGE2 预处理：将 c-Kit⁺细胞重悬于含 10% 胎牛血清的 IMDM 培养基中，加入PGE2(Cat#60810ES) 10 μM，37℃、5% CO₂孵育2 小时；对照组加入等量 DMSO(Cat#60313ES)。

5) 细胞洗涤：孵育结束后，用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，重悬于 PBS 中备用。

实验步骤

1) 受体小鼠准备：8-10 周龄 BoyJ 小鼠（CD45.1）经致死剂量 X 射线照射（11 Gy，分两次照射，间隔 3 小时）。

2) 细胞移植：照射后 24 小时内，通过尾静脉注射不同处理组的 c-Kit⁺细胞（每只小鼠注射 1×10⁵个细胞）。

3) 外周血嵌合率检测：移植后 4 周、8 周、12 周、16 周、24 周，尾静脉采血，用抗 CD45.1 和抗 CD45.2 抗体染色，流式细胞术检测供体来源细胞（CD45.2⁺）的嵌合率。

4) 多系分化分析：移植后 24 周，处死小鼠，取骨髓细胞，用抗 CD3（T 细胞）、抗 B220（B 细胞）、抗 Gr-1/CD11b（髓系细胞）抗体染色，流式细胞术检测供体来源细胞的多系分化情况。

实验结果

• PGE2 预处理组小鼠在移植后 4 周外周血供体细胞嵌合率达到约 40%，而对照组仅为约 10%；
• 移植后 24 周，PGE2 预处理组供体细胞嵌合率仍维持在约 60%，显著高于对照组的约 20%；
• PGE2 预处理组供体细胞可正常分化为 T 细胞、B 细胞和髓系细胞，多系分化潜能未受影响。

图2 前列腺素 E2 增强小鼠造血干细胞体内重建能力。(a-b) 体外处理全骨髓或 HSC 后，第 8 天 (a) 和第 12 天 (b) 的 CFU-S 脾脏重量；(c) 吲哚美辛对 CFU-S12 脾脏重量的影响；(d) dmPGE2 处理 KSL 细胞后的 CFU-S12 集落数；(e) 竞争性移植后 CD45.1 嵌合率的代表性 FACS 图；(f-j) 移植后 6 周、12 周、24 周的平均嵌合率及植入频率；(k-l) cox1/cox2 抑制剂对 CFU-S12 集落数和脾脏重量的影响；(m-n) 5-FU 骨髓损伤后外周血和骨髓白细胞计数的恢复情况。来源：North TE et al. Nature, 2007, Supplementary Figure 4

实验步骤

1) 细胞标记：将 PGE2 或 DMSO 预处理的 c-Kit⁺细胞用 CFSE 荧光染料标记。

2) 细胞移植：将标记后的细胞（每只小鼠注射 2×10⁶个细胞）经尾静脉注射入经亚致死剂量照射的 C57BL/6 小鼠体内。

3) 归巢效率检测：移植后 16 小时，处死小鼠，取出股骨和胫骨，制备骨髓单细胞悬液，流式细胞术检测 CFSE 阳性细胞比例，计算 HSC 归巢效率。

实验结果

• PGE2 预处理组 HSC 向骨髓的归巢效率约为对照组的 2.5 倍；
• PGE2 处理可显著上调 HSC 表面 CXCR4 的表达水平；
• CXCR4 拮抗剂 AMD3100 可完全阻断 PGE2 对 HSC 归巢的增强作用。

图3 前列腺素 E2 对造血干细胞骨髓归巢的影响。骨髓细胞用 CFDA 标记后，体外经 dmPGE2 或对照处理并移植入照射受体，12 小时后流式检测骨髓中 CFDA + 细胞比例，两组无显著差异（p=0.83，n=10）。来源：North TE et al. Nature, 2007, Supplementary Figure 5