Q：
RCA实验阴性背景高、非特异性扩增严重，如何逐层排查优化？
- 引物体系优化：下调硫代引物终浓度至 0.1–1 μM，检查引物是否存在分子内二聚体、3' 端错配；
- 模板前处理：使用 Exo I+Exo III 消化未环化线性 DNA，消除线性模板引发的杂扩增；
- 反应组分调整：dNTP mix降至 100–300 μM 区间，小幅降低镁离子浓度；
- 外源污染排查：更换全新分装无酶水、缓冲液、耗材，单独设置无模板对照区分体系污染与模板自带杂质。
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