ApplicationsGeneticin遗传霉素在分子遗传试验转染中的应用

遗传霉素（Geneticin，G418）是一种氨基糖苷类抗生素，它通过与原核和真核细胞的70S和80S核糖体结合，阻断肽链延伸，从而抑制蛋白质合成。这一机制对包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等都有毒性。当细胞成功转染并整合含有新霉素抗性基因（如neo基因）后，该基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶（APH(3)II）能够共价修饰G418，使其失活，从而赋予细胞在含有G418的选择性培养基中生长的抗性。

在分子遗传试验中，G418是稳定转染常用的抗性筛选试剂之一。

G418通过抑制蛋白合成，用于筛选含有抗性基因（如neo基因）的细胞。抗性基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶能使G418失活，从而赋予细胞对G418的抗性。通常情况，哺乳动物细胞筛选范围是200-2000 μg/mL，最常用的工作浓度为100-700 μg/mL。其中植物细胞是10-100 μg/mL；酵母细胞是500-1000 μg/mL，以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度，可做参考。

在细胞培养过程中，G418用于筛选能够抵抗该抗生素的细胞，这些细胞通常携带有特定的抗性基因。

1）活力单位的换算
根据此公式进行换算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而异。可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
比如若所用批次的G418 活力值为：750 U/mg，要配制50 mg/mL的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mL。
如果配制10 mL的G418储存液（活性浓度，50 mg/mL），则需要称取666.7 mg粉末。
2）除菌和保存
根据上述换算得到的实际粉末称重量，加入10 mL无菌去离子水内使其完全溶解。
先用5 mL无菌去离子水预湿润0.22 μm针头式过滤器，除尽水。之后使用此滤器过滤，除菌后分装成单次使用的小量（如1mL）放到-20℃冻存，1年稳定。

1) 第一天：未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO₂培养过夜；
2) 根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度，至少选择6个浓度（处理分裂期的细胞时G418的活性最强，因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间），以哺乳动物细胞为例，可设定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3) 第二天：去除旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基，每个浓度做三个平行孔。
4) 接下来每3-4天更换新的含药物培养基。
5) 按照固定的周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。

1）转染48 h后，用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。

2）每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。

3）筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染以及筛选效果。

4）挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

5）之后更换正常培养基培养即可。

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以大肠杆菌为实验对象，G69和G99是两个不同的批次；基因组霉素的使用浓度分别为8 mg/L、12 mg/L和16 mg/L，有效最小浓度为16 mg/L，完全抑制了杂菌的生长。

图1.不同批次间基因组霉素有效浓度的稳定性试验和验证

注意事项

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