应用案例细胞侵袭 | 结肠癌(HCT116)细胞侵袭实验案例

实验所用产品：

一、Transwell小室基底膜制备

基质胶解冻：实验前一日，将Ceturegel®基质胶从-20°C转移至置于冰上，于4°C冰箱过夜，使其完全融化为液态。

铺胶与固化：全程在冰上操作，以防止基质胶提前凝固。将适量稀释的Ceturegel®基质胶均匀包被于Transwell小室底部膜的上室面。将小室置于超净工作台内，室温下风干约3小时，使基质胶牢固附着于膜上。
注：此“风干”法不同于常规的37°C凝胶化，具体操作应依据所用基质胶的产品说明书进行确认。

二、实验细胞准备

细胞消化与洗涤：取对数生长期的HCT116细胞，常规胰酶消化。离心收集细胞后，用PBS轻柔洗涤1-2次，以彻底去除残留的血清。

细胞悬液制备：使用无血清培养基重悬细胞，并通过细胞计数将密度精确调整至 5×10⁵个/mL。

三、细胞接种与共培养

建立趋化梯度：在24孔培养板的下室各孔中加入 600 µL 含 10% FBS 的完全培养基作为趋化剂。

接种细胞：取 200 µL 细胞悬液（即含 1×10⁵个细胞），小心加入Transwell小室的上室。

避免气泡：操作时需特别注意，确保下层培养液与小室底部膜之间无气泡产生，否则会严重影响趋化效果。

孵育培养：将组装好的培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，分别培养 12小时、24小时和48小时，以获取不同时间点的侵袭数据。

四、固定、染色与结果分析

固定：到达预定时间点后，取出Transwell小室，弃去培养液。用PBS淋洗小室两次。

关键步骤：用湿润的棉签，小心地擦拭上室膜内表面，彻底去除未穿透的细胞。将小室放入盛有 4% 多聚甲醛（或95%酒精）的24孔板中，室温固定 20分钟。

染色：固定后，弃去固定液，直接用 0.1%结晶紫溶液（或其它核染料）室温染色 15分钟。

漂洗与观察：染色后，用流水或PBS轻轻漂洗小室，去除多余染液，室温晾干。

细胞计数与数据分析：将小室置于倒置显微镜下观察。每个样本随机选择5个视野进行拍照。计数每个视野中穿过膜的细胞数，计算该时间点下该样本的平均值。

实验结果：随着接种时间的推移，穿膜的细胞逐渐增多。

图1：接种12h	图2：接种24h	图3：接种48h

（数据来源：广东医科大学）

细胞侵袭实验小贴士

1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。

2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。

3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。

4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。

5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。

6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。

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