应用案例HiActi细胞因子 | 结肠癌类器官培养案例

为去除细胞沉淀中的红细胞，在冰盒中加入2 mL红细胞裂解液（40401ES）裂解5分钟，然后以600 g离心，PBS重悬沉淀，用台盼蓝（40724ES）计数，再以600 g离心5 min，保留细胞沉淀立即培养。

将切下来的组织块放于20 mL四抗（青/链霉素（60162ES）+两性霉素B（60238ES）+庆大霉素（54076ES））运输液中保存过夜。

将样本至于15 mL离心管（83506ES）中，并加入5 mL含四抗的PBS（60158ES）冲洗2-3次，至PBS稍微变得干净透亮，再转入无菌培养皿中。

用无菌手术剪在含3 mL四抗PBS的无菌培养皿中将组织块剪碎，去除组织中血液、脂肪、绒毛等杂质，剪成可以过剪枪头大小，将剪碎的组织块转移至15 mL离心管中，加入3 mL含四抗的PBS，600 g离心5 min，并更换含四抗的PBS反复离心冲洗2-3次。

向离心管中加入组织块两倍体积消化液（41423ES），在37℃条件下，160 rpm摇床30 min。

过细胞筛（84702ES），加入10 mL含四抗的PBS冲洗，600 g离心5 min，获得细胞沉淀。

提前准备好基质胶（Ceturegel）（40192ES）、预冷的200 μL枪头（83050ES）及24孔细胞培养板（84013ES）（恒温培养箱预热）。

根据细胞沉淀的量加入适量完全培养基，与基质胶混合，此过程在冰上操作，轻轻吹打至充分混匀（避免在吹打过程中产生大量气泡，以免影响后续种板）。

将混合液接种于预热的24孔细胞培养板中，每孔接种50 μL，倒置于37℃细胞培养箱中，使类器官培养物保持半球形状。

1h后向每孔轻轻加入500 μL事先配置好的完全培养基，37℃置于含5% CO₂的细胞培养箱中持续培养。

定期观察类器官生长情况，检查类器官是否有污染，通过观察类器官生长速度、形态及培养基状况，适时更换培养基或进行传代。

当观察到类器官长势迅速、生长过于密集或囊泡结构边缘变黑时，应根据实验需要进行传代及冻存。

弃去原培养基，加200 mL Dispase（40104ES）溶解基质胶，放入培养箱消化1h。

加入200 mL DMEM/F12（41420ES）培养基终止消化，吹洗分离基质胶，之后转入15 mL离心管中，以600 g离心5 min，保留细胞沉淀。

加入1 mL PerfCell Tryzyme™ Express（40135ES）消化分离类器官，吹打2 min，加入1 mL DMEM/F12培养基终止消化，以600 g离心5 min，收集细胞沉淀，根据实验需要进行接种培养。

按照传代过程获得细胞沉淀后，加入细胞沉淀三倍体积的细胞冻存液，吹打混匀细胞沉淀，保证每个冻存管（84105ES）有相同数量的细胞，以便后续复苏。

将冻存管置于程序降温盒中，在-80℃冰箱放置24h后，再转移至液氮进行长期保存。

将类器官转移至含5 mL DMEM/F12培养基的离心管中，轻轻混匀，以600 g离心5 min，收集细胞沉淀。

准备15 mL离心管，加入5 mL DMEM/F12培养基;

从液氮中取一管冻存的类器官，立即放入37℃水浴锅中不断摇晃解冻，融化至略有冰碴时取出。