应用案例细胞侵袭│人肝癌(Huh7)细胞侵袭实验案例

实验所用产品：

一、Transwell小室基底膜制备

基质胶解冻与稀释：将Ceturegel®胶置于4°C冰箱过夜融化。用预冷的DMEM培养基将其稀释至 2.5% 浓度，全程冰上或低温操作。

铺胶与凝胶化：吸取 50 μL 稀释后的基质胶，轻轻加入Transwell小室上室的中心区域。将小室置于超净工作台中，室温静置 1小时，使ECM胶完全凝固。

二、实验细胞准备

细胞悬液制备：取对数生长期的Huh7细胞，常规胰酶消化，离心收集。用含 10% FBS 的DMEM培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度至 5×10⁴个/mL。

三、细胞接种与共培养

接种细胞：向Transwell上室加入 200 μL 细胞悬液（即含 1×10⁴个细胞）。

建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 600 μL 含 15% FBS 的DMEM完全培养基。

关键提示：确保小室底部膜与下室液体之间无气泡，否则会削弱趋化作用。

孵育培养：将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，常规培养 24小时。每组设置3个复孔。

四、固定、染色与结果分析

固定：培养结束后，小心吸去上室和下室的培养基。分别在上室加入 200 μL、下室加入 600 μL 的 4% 多聚甲醛，室温固定细胞 30分钟。

干燥：弃去多聚甲醛，将小室室温干燥约 5分钟。

染色：分别在上室加入 200 μL、下室加入 600 μL 的 0.1% 结晶紫染色液，室温染色 40分钟。

漂洗与清除：移除结晶紫染液，用PBS清洗小室 5分钟。吸去PBS，用湿润的棉签非常轻柔地擦去上室膜表面的细胞（未侵袭细胞）。

观察与计数：将小室置于正置显微镜下，观察下室膜表面已迁移/侵袭的细胞，记录细胞大小及个数。随机选择至少5个视野进行拍照和计数，取平均值进行统计分析，以此量化Huh7细胞的侵袭能力。

图1：对照组	图2：处理组

（数据来源：哈尔滨医科大学）

细胞侵袭实验小贴士

1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。

2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。

3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。

4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。

5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。

6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。

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