Buying Guides翌圣生物iPSC/诱导多能干细胞培养全流程选购指南

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是指通过人工对体细胞进行重编程，逆分化培养出的一类具有类似人胚胎干细胞特征的多能干细胞。iPSC具有多向分化和强大自我复制潜能，在一定条件下可以分化成多种功能细胞，且可以在体外培养获得数百万甚至数十亿的临床相关表型细胞，如心肌细胞、神经元细胞、胰岛细胞等，在临床治疗、药物研发、医疗美容等多个领域具有广阔的应用前景。

图1. iPSC治疗示意图

iPSC相较于其他类型的干细胞，如胚胎干细胞（ESC）、成体干细胞（ASC），具有显著的优势，这些优势使其在再生医学、药物研发和疾病模型等领域具有巨大的应用潜力。以下是iPSC的主要优势：

图2. iPSC的优势

将体细胞重编程为具有人胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞（iPSC），在科研及治疗等领域均有重大意义。iPSC作为一种新兴技术，目前产业化应用尚处于早期发展阶段，但iPSC在临床上已有多种应用尝试，涉及的应用领域主要包括疾病研究、药物筛选、细胞治疗等。

图3. iPSC的应用领域

iPSC的制备是一个将已分化的体细胞（如皮肤成纤维细胞、血细胞等）重编程为具有类似胚胎干细胞多能性状态的过程。其核心在于通过特定方法，将一系列“重编程因子”（通常是转录因子）导入体细胞，从而逆转其发育时钟，使其回到多潜能状态。

图4.由皮肤成纤维细胞制备iPSC过程

细胞来源：从供体获取容易培养的体细胞，最常见的是皮肤成纤维细胞或外周血单个核细胞，也可用尿路上皮细胞、肝细胞等。

以人类真皮成纤维细胞为例，制备过程如下：

1)获取6 mm皮肤穿刺活检样本。
2)立即将活检样本置于含人类成纤维细胞（hFib）培养基（DMEM，10% FBS，2 mM L-Gln，50 U/mL penicillin，50 mg/mL streptomycin）的容器中，冰浴运输至实验室。后续所有步骤均在组织培养超净工作台中进行。
3)用无菌镊子和解剖剪将皮肤活检样本剪切成0.5-1 mm³大小的组织块。
4)将组织块放置在6孔板的孔中央，加入足量hFib培养基覆盖孔底。
5)小心将无菌盖玻片覆盖在组织块上，使其紧贴孔底固定，然后补充hFib培养基至总体积3 mL。
6)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育。
7)7-10天后，应出现密集生长的成纤维细胞。吸弃培养基，用PBS洗涤两次。用无菌镊子轻轻松动并提起盖玻片，确保培养基已被PBS冲洗干净。成纤维细胞会粘附在盖玻片上，注意避免吸弃这些细胞。
8)加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液。用无菌镊子提起盖玻片，确保胰蛋白酶能够接触到盖玻片下粘附的成纤维细胞，37℃孵育5 min。
9)用无菌镊子将盖玻片翻转，在37℃下继续孵育5 min。
10)用5 mL移液管加入2.5 mL hFib培养基终止胰蛋白酶作用。通过轻柔地反复吹吸，以及刮擦孔底和盖玻片，使细胞分散均匀。将细胞收集至15 mL离心管中。
11)用3-5 mL hFib培养基洗涤孔和盖玻片两次，以收集所有细胞。
12)将细胞悬液通过70 μm细胞筛，去除大块组织碎片。
13)室温200 g离心4 min，弃去上清液。
14)用5 mL hFib培养基重悬细胞，接种至T-25组织培养瓶中（第二代）。
15)每5-7天或细胞融合度达到80%时，以1:3的比例传代。为方便使用，可使用150 mm组织培养皿进行扩大培养。
16)后续传代时，吸弃培养基，用PBS洗涤一次，加入0.05%胰蛋白酶在37℃下孵育5 min。继续以1:3的比例传代，细胞最多可传至10代。

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这是最核心的技术环节，有多种方法，各有利弊。

整合性病毒法（经典方法）：
逆转录病毒/慢病毒：能高效地将外源基因整合到宿主细胞基因组中并稳定表达。优点是效率较高，缺点是存在插入突变、致癌风险，且部分病毒在iPSC中可能沉默。

非整合性方法（为临床转化开发）：
附加型载体（如仙台病毒、EBV载体）：能在细胞质中自主复制，不整合到基因组，随着细胞分裂逐渐丢失。
非整合型质粒/转座子：通过电转或化学法导入，短暂表达后丢失。
mRNA直接转染：将编码重编程因子的mRNA直接转入细胞，完全避免基因组整合，但需多次转染，技术难度高。
重组蛋白：将重编程因子蛋白直接送入细胞，最安全但效率极低。
小分子化合物：使用化学小分子部分替代转录因子，提高效率或安全性。

以逆转录病毒为例，其制备方法如下：

1)准备293T，100 mm皿培养至60-70%汇合，用于病毒包装。
2)第1天：吸弃293T细胞的培养基，更换为10 mL新鲜的293T细胞培养基。
3)对于每个10 cm培养皿，加入2-10 μg/mL转染试剂和300 μL DMEM，混合均匀后，在室温下孵育5 min。
4)加入2.5 μg逆转录病毒载体、0.25 μg VSV-G和2.25 μg Gag-Pol。
5)混合均匀后，在室温下孵育15 min。
6)将转染试剂-DNA复合物逐滴加入细胞中，轻轻摇晃培养皿，确保复合物均匀分布在整个培养皿表面。
7)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育48h。
8)第3天：收集含逆转录病毒的培养基，通过0.45 μm过滤装置过滤。
9)将含逆转录病毒的培养基转移至离心管中，4℃，70,000 g离心90 min。
10)弃去上清液，加入1 mL DMEM轻轻摇晃，覆盖病毒沉淀。在4℃下静置过夜，使沉淀溶解。
11)第4天：若有必要，用100 μL移液管吸吹DMEM，直至沉淀完全溶解。
12)测定每种病毒的滴度，确定感染复数（MOI）。

人类真皮成纤维细胞的逆转录病毒感染

1)感染第1天：当hFib细胞融合度达到80%时，吸弃培养基，用PBS洗涤一次，加入0.05%胰蛋白酶覆盖细胞，在37℃下孵育5 min。
2)用hFib培养基终止胰蛋白酶作用，将细胞收集至50 mL离心管中。
3)在室温下以200 g离心4 min，弃去上清液。
4)用1 mL hFib培养基重悬细胞，计数。
5)用hFib培养基稀释细胞悬液，调整浓度至5×10⁴个/mL。
6)向6孔板的每个孔中加入2 mL hFib细胞悬液。
7)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育6小时。
8)吸弃培养基，更换为逆转录病毒感染培养基，并加入5 μg/mL硫酸鱼精蛋白。
9)加入OCT4、SOX2、KLF4、MYC病毒（MOI=5）以及hTERT和SV40 LT（MOI=1）。另取一个孔加入空载体进行感染，作为未转导的重编程对照，按相同流程操作。
10)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育24h。
11)第2天：吸弃培养基，用3 mL PBS洗涤细胞三次，加入2 mL新鲜的逆转录病毒感染培养基。
12)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育72h。
13)第4天：制备明胶包被的组织培养皿。
14)从液氮中取出一管冻存的辐照后小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs），置于37℃水浴中轻轻摇晃，直至大部分内容物解冻。
15)用70%乙醇喷洒冻存管并擦干后，放入组织培养超净工作台。
16)缓慢加入1 mL预热的MEF培养基（DMEM，10% FBS，2 mM L-Gln，50 U/mL penicillin，50 mg/mL streptomycin），与冻存管内的细胞悬液混合，转移至含4 mL预热MEF培养基的15 mL离心管中。
17)在室温下以200 g离心4 min，弃去上清液。
18)用12 mL MEF培养基重悬iMEFs。
19)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育过夜。
20)第5天：将所有感染后的细胞（约2.5×10⁵-5×10⁵个细胞）接种到含iMEFs的培养皿中。吸弃步骤12中孵育细胞的逆转录病毒感染培养基，用PBS洗涤，加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶，在37℃、5%二氧化碳条件下孵育5 min。
21)用3 mL逆转录病毒感染培养基终止胰蛋白酶作用，将细胞收集至15 mL离心管中。
22)在室温下以200 g离心4 min。
23)吸弃步骤19中iMEFs培养皿中的MEF培养基，加入5 mL逆转录病毒感染培养基，放回培养箱。
24)吸弃步骤22中细胞的上清液，用5 mL逆转录病毒感染培养基重悬细胞，加入到含iMEFs的逆转录病毒感染培养基中。
25)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育iMEFs 48h。
26)第6天：吸弃培养基，更换为添加Y-27632（终浓度10 mol/L）的hES细胞培养基（20% KSR、5–10 ng/mL bFGF、1 mM L-Gln、100 mM nonessential amino acids、100 mM 2-mercaptoethanol、50 U/mL penicillin、50 mg/ml streptomycin。）。

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1)第1天：每天更换10 mL hES细胞培养基。
2)当感染后的细胞过度融合且iPS细胞尚未出现时，制备新鲜的iMEFs培养皿，将每个100 mm培养皿中的感染后hFib细胞按1:3的比例传代。
3)吸弃制备好的iMEFs培养皿中的MEF培养基，用1-2 mL DMEM/F12洗涤，向每个培养皿中加入5 mL hES细胞培养基，放回培养箱。
4)吸弃感染后hFib细胞的培养基，用10 mL DMEM/F12洗涤培养皿。
5)向每个培养皿中加入5 mL胶原酶溶液（1 mg/mL，溶于DMEM/F12）。
6)在37℃下孵育培养板10 min。
7)用5 mL移液管分别沿水平、垂直和圆周方向刮取细胞。
8)当所有克隆均从培养皿表面脱落时，将悬液收集至15 mL无菌离心管中。
9)用5 mL DMEM/F12培养基洗涤每个孔，将洗涤液加入15 mL离心管中（每个100 mm培养皿的总体积为10 mL）。
10)在室温下以200 g离心4 min。
11)从培养箱中取出含hES细胞培养基的iMEFs培养皿，做好标记。
12)吸弃上清液，用15 mL hES细胞培养基轻轻重悬沉淀。
13)向每个含hES细胞培养基的iMEFs培养皿中加入5 mL细胞悬液。
14)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育。

15)hFib细胞感染后21-30天，应开始出现人类胚胎干细胞样克隆。这些克隆是均一的细胞簇，具有人类胚胎干细胞的形态特征——核质比高、核仁明显，且已将周围的异质性细胞推开。当“克隆”大小达到约50-150个细胞（直径2-3 mm）时，即可进行挑取。

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1)第1天：挑取克隆前1-2天，用iMEFs制备12孔板。
2)吸弃iMEFs的MEF培养基，用1.5 mL DMEM/F12洗涤，向每个孔中加入1.5 mL hES细胞培养基，将培养板放回培养箱。
3)使用量程为20 μL的移液器（调至10 μL），挑取单个iPS细胞克隆，将每个克隆分别接种到含hES细胞培养基的iMEF 12孔板的每个孔中。
4)在37℃、5%二氧化碳条件下孵育过夜，48小时内不扰动细胞。
5)第4天：每天更换2 mL hES细胞培养基。
6)7天后，克隆大小足以进行传代。
7)iPS细胞制备完成后，应按照人类胚胎干细胞的培养方式进行处理。

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这是验证成功与否的关键步骤，包括：
1)形态学鉴定：在显微镜下观察典型的ES细胞样克隆形态。
2)多能性标志物检测：
碱性磷酸酶染色：多能干细胞呈强阳性。
免疫荧光/流式细胞术：检测核心多能性蛋白（如OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81）的表达。
3)基因表达分析：通过RT-PCR或RNA测序，确认内源性多能性基因（如OCT4、NANOG）被激活，而供体细胞特异性基因被沉默。
4)体外分化能力：通过拟胚体形成实验，观察iPSC能否自发分化为三个胚层（内胚层、中胚层、外胚层）的细胞。
5)体内分化能力（金标准）：将iPSC注射到免疫缺陷小鼠皮下，形成畸胎瘤。组织学切片应包含来自三个胚层的多种组织（如软骨、上皮、神经管等），证明其真正的多能性。
6)核型分析：检查染色体是否正常，无重大结构异常。

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