技术讲解选对关键酶原料，让LAMP/RT-LAMP更灵敏、更快捷！

等温扩增技术可在恒温条件下实现扩增特异性核酸序列的目的，因无需专用的仪器设备、扩增时间短、灵敏度高等特点，在现场检测和即时诊断中显示了良好的应用前景，非常适于分子诊断工具的开发。

根据不同的扩增原理，等温核酸扩增技术可分为很多类，主要包括环介导等温扩增(LAMP)、交叉引物扩增 (CPA)、链替代扩增 (SDA)、重组酶聚合酶扩增 (RPA)、依赖核酸序列的扩增 (NASBA)、滚环扩增 (RCA)和依赖解旋酶的扩增 (HAD)等。目前最常见、应用最广的当属日本学者Notomi等在2000年开发的环介导核酸等温扩增技术LAMP，其技术特征是针对靶基因上的6个区域设计4~6条引物，利用链置换型的Bst DNA聚合酶在60℃~65℃恒温条件下进行扩增反应，在15-60 min内实现目标序列10⁹-10¹⁰倍的扩增。

针对LAMP/RT-LAMP技术，翌圣生物可提供高品质等温扩增核心酶原料，包括链置换Bst DNA聚合酶、MMLV逆转录酶、防污染UDG酶、RNase抑制剂，目前已获得众多客户的好评，完美替换进口品牌，为客户解决了货期和成本问题。

翌圣生物Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）是将缺少5′→3′外切核酸酶结构域的Thermophilic Geobacillus sp DNA 聚合酶基因在E.coli 中表达纯化而得。该酶链置换能力强，具备高灵敏度、高扩增效率、高dUTP耐受性的优势，可广泛应用于基于等温扩增技术的病原体即时检测。

图1. 用翌圣Bst Plus DNA Polymerase进行RT-LAMP反应，扩增新 冠病毒。25 μL反应体系中，50 copies/T的检出率达100%，反应时间＜15 min。

使用翌圣Bst Plus DNA Polymerase进行RT-LAMP反应，扩增新 冠病毒(20 copies/T)。在推荐反应方案中引入dUTP/UDG酶防污染系统，使用dUTP替换dTTP。对比全U（35 mM）替换（红色扩增曲线）与T：U = 1：1（蓝色扩增曲线）的扩增结果发现，在反应体系中添加dUTP对Bst Plus DNA Polymerase的灵敏度及扩增效率无影响，该酶具有较高的dUTP耐受性。

图2. 翌圣Bst Plus DNA Polymerase高dUTP耐受性验证结果

翌圣生物Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶（Cat#11111ES、14601ES）cDNA合成速度快，热稳定性高，可耐受高达65℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板及低拷贝基因的逆转录。此外，本品可扩增长达19.8 kb的cDNA。

图3. 以300 ng 297T细胞总RNA为模板，使用Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase（Cat#11111ES）在42~65℃下进行反转录。取1μL cDNA为模板，使用2×Hieff Canace^® Gold PCR Master Mix高保真酶预混液（Cat#10149ES）扩增不同类型模板结果图。

图4. 以10 pg~5 μg297T细胞总RNA为模板，使用Hifair^® Ⅲ Reverse Transcriptase（Cat#11111ES）合成cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff UNICON^® Power qPCR预混液（Cat#11195ES）扩增PTTG1基因。

翌圣生物Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG) , 1 U/μL（Cat#14455ES）能催化水解含有尿嘧啶的DNA链的尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架的N-糖苷键，释放游离尿嘧啶，无核酸酶、切口酶、RNase酶残留，可轻松控制气溶胶污染。本品适用于PCR、qPCR以及RT-qPCR等常见分子生物学体系。

0.025 U防污染UDG酶即可完全消化360 ng 200 bp的dU-DNA。

图5. 0.05 U、0.025 U、0.0125 U、0.00625 U、0.003125 U防污染 UDG酶与360 ng 200 bp dU-DNA在25℃孵育30 min电泳结果图。

完美兼容下游qPCR以及RT-qPCR反应体系，在高投入量下对检测体系无影响。

图6. 不同浓度防污染UDG酶可兼容qPCR以及RT-qPCR反应体系，对DNA及RNA模板扩增无抑制。

翌圣生物Murine RNase Inhibitor（Cat#10603ES、10610ES、14671ES）是以可溶形式在大肠杆菌中表达纯化的重组鼠源RNase抑制剂，能够广泛抑制各种类型RNase (RNase A, B, C)。经RT-PCR、RT-qPCR检验，本产品能与各种逆转录酶及DNA Polymerase兼容。

图7. 1μL Murine RNase inhibitor（40 U/µL, Cat#10603ES）可有效抑制5ng RNase，1μg HEK细胞总RNA电泳结果图。

表8. 不同浓度梯度的 MRI 与 100 ng RNase A 共孵育以封闭 RNase A 的活性，再消化处理 1 μg RNA。用一步法 RT-qPCR 的方法检测 RNA的降解情况，以此来判断 MRI 对 RNase A 的封闭效果。PC 代表体系中仅RNA不加 RNase A 和 MRI。