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应用案例Plvx-PGK质粒 | 80mL菌液质粒大提案例

📂 核酸提取与纯化类型 ID 5002

👁 14,298 次浏览 🗓 2026-10-09 源站内容 ID：2013120267313262592

实验所用试剂清单试剂19037ES 无内毒素质粒大量提取试剂盒V2转染试剂：40802ES细胞：293T无水乙醇异丙醇耗材50 mL离心管2 mL细心管50 mL离心管架设备Thermo角转子离心机移液器琼脂糖凝胶电泳设备Nanodrop操作步骤01菌体收集、裂解与澄清1.菌体收集：通过多次离心收集所需要的菌体量。取80 mL菌液分装到2个50 mL离心管

来源：翌圣生物｜原文：https://www.yeasen.com/solutiondetail/2013120267313262592 ↗

实验所用试剂清单

试剂	19037ES 无内毒素质粒大量提取试剂盒V2	转染试剂：40802ES 细胞：293T	无水乙醇	异丙醇
耗材	50 mL离心管	2 mL细心管	50 mL离心管架
设备	Thermo角转子离心机	移液器	琼脂糖凝胶电泳设备	Nanodrop

操作步骤

菌体收集、裂解与澄清

1.菌体收集：通过多次离心收集所需要的菌体量。

取80 mL菌液分装到2个50 mL离心管中，6000×g离心3 min，弃上清。

2.重悬菌体：加入10 mL溶液SI，振荡至无可见菌块。

3.裂解处理：加入10 mL溶液SII，轻柔翻转混匀4~10次，形成透明裂解液（裂解时间4 min）。

4.中和并澄清沉淀：加入8 mL溶液SIII，100 µL RNase A，翻转混匀10次，室温静置10 min，10000×g离心5 min。

5.使用推杆过滤器将上清液过滤至50 mL尖底离心管（得约25mL上清），加10 mL 结合液PB混匀备用。

质粒纯化

6.吸附柱平衡：（建议在处理上清液期间处理）向吸附柱E2加4 mL平衡液BS，静置2 min，6000×g离心2 min，弃废液。
7.吸附柱吸附质粒：步骤5所得混合液，通过多次离心，将样品吸附到吸附柱E2柱中。混合液用量9 mL/次，分4次离心，6000×g离心2 min。。
8.漂洗：加入8 mL溶液W1漂洗一次，8 mL漂洗液WS（漂洗两次），每次6000×g离心2 min
9.干燥：10000×g空离5 min，并室温放5 min彻底去除乙醇。

质粒洗脱

10. 加入1.2 mL洗脱缓冲液EB，室温静置5 min，10000×g离心3 min收集洗脱液。

细节注意

1.结合液的比列一定要准确，不能加少，可以略多加；

2.菌体一定要打散，如果成块裂解不完全，会影响质粒得率；

3.加入无水乙醇和异丙醇之后，一定要剧烈晃均匀。

质检结果

样本	浓度（nanodrop）	A260/A280	A260/A230
1	700 ng/μL	1.9	2.0

293T细胞转染

实验结论

3个pCMV质粒样本，从80 mL菌液中提取的质粒DNA浓度为700 ng/μL，该浓度符合转染实验要求。随后使用翌圣转染试剂（40802ES）将质粒转染至293T细胞，转染效率显著。

数据来源：上海某高校

来源与原文

来源： 翌圣生物

原文链接： https://www.yeasen.com/solutiondetail/2013120267313262592

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