应用案例植物样本RNA提取及建库案例

实验所用试剂设备清单

实验前准备

1．自备设备和试剂：台式离心机、振荡仪、水浴锅或金属浴，RNase-free离心管，β-巯基乙醇、无水乙醇等。

2．实验前在裂解液PL中加入β-巯基乙醇至终浓度为5%，如760 μL裂解液PL中加入40 μL β-巯基乙醇。此裂解液现用现配最佳。

操作步骤

1. 用液氮将植物研磨成粉末，称取50~100 mg粉末至2.0 mL离心管中。加入700~900 μL预配的裂解液PL，再加入20 µL蛋白酶K，涡旋混匀样本，室温放置2~3min。4℃，12,000×g离心3min后取所有上清于1.5 mL离心管中。

2. 加入200 μL分层液SF，手动剧烈振荡15s，4℃放置2~3min。4℃，12,000×g离心5min后取500 μl上层水相溶液提取。(分层液SF能有效去除多糖多酚植物中的多糖、多酚、蛋白质及色素等杂质，提高RNA纯度。)

3. 取步骤2.1的上清溶液于新的1.5 mL离心管中，加入500 µL结合液RB、20 µL磁珠悬浮液，振荡或涡旋7~10min使磁珠吸附核酸。

4. 转移至磁力架上进行磁分离至溶液澄清，吸弃溶液。

5. 加入700 µL洗涤液DW1，涡旋30s后转至磁力架上进行磁分离至溶液澄清，吸弃溶液。

6. 加入500 µL洗涤液DW2，涡旋30s后转至磁力架上进行磁分离至溶液澄清，吸弃溶液。

7. 掌上离心机瞬时离心后，转至磁力架上吸附至溶液澄清，充分吸弃所有溶液。

8. 加入700 μL消化液DR和10 μL DNaseⅠ，涡旋打散磁珠，室温轻柔震荡10~15min（如无震荡仪每3~4min涡旋1次，每次30s）。

9. 转移至磁力架上进行磁分离至溶液澄清，吸弃溶液。

10. 加入700 µL洗涤液DW2，涡旋30s后转至磁力架上进行磁分离至溶液澄清，吸弃溶液。

11. 再次加入500 µL洗涤液DW2，涡旋30s后转至磁力架上进行磁分离至溶液澄清，吸弃溶液。

12. 掌上离心机瞬时离心后，转至磁力架上吸附至溶液澄清，充分吸弃所有溶液，打开管盖，空气干燥3~5min。

注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。切勿干燥过久，以免影响后续洗脱效果。

13. 加入30~60 µL洗脱液RE，高速涡旋2~3min打散磁珠。

14. 45℃温浴5min，然后高速涡旋60s。

15. 瞬时离心收集管盖液滴至管中，转移至磁力架上进行磁分离。

16. 提取的RNA溶液转移至新的1.5 mL无菌无核酸酶的离心管中，如果不立即使用，请存储于-15~-25℃，长期保存请放置于-70℃或更低的温度。

质检结果—RNA浓度和纯度分析

质检结果—RNA完整度分析

RNA文库构建-文库产量和大小分析

实验结论

采用翌圣生物 18613ES 通用型磁珠法总 RNA 提取试剂盒，分别对丝瓜叶、葡萄叶进行总 RNA 提取。通过超微量分光光度计检测 RNA 浓度与纯度（A260/A280、A260/A230 比值），结合琼脂糖凝胶电泳评估 RNA 完整性，并进行转录组文库构建验证。结果表明：所提取 RNA 浓度高、纯度优良、完整性良好，文库产量及片段分布峰形均符合建库预期，可满足后续转录组测序等下游实验需求。

数据来源：上海某大学课题组