Case Studies人T细胞激活实验方案

实验准备

完全培养基配方供参考：RPMI-1640（41402ES，终浓度90%）胎牛血清（终浓度40132ES，10%）丙酮酸钠（60171ES，终浓度1x）L-谷氨酰胺（60757ES，终浓度1x）HEPES（60117ES，终浓度1x）青霉素-链霉素（60162ES，终浓度1x）β-巯基乙醇（52644ES，终浓度55μM）

实验步骤

一、抗体包被（实验前一天进行）

1. 将抗人CD3单克隆抗体(92674ES)稀释至PBS中，最终浓度为3 µg/mL。

2. 将稀释后的抗人CD3单克隆抗体按每孔1 mL加入24孔板（84013ES）中固定。

3. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。

4. 从4℃取出包被好的培养板，弃去孔内的抗体溶液。

5. 用无菌PBS（41403ES）轻轻洗涤每个孔2-3次，以去除未结合的抗体。

二、细胞制备

1. 准备人外周血单个核细胞（PBMC）的单细胞悬液。对于T细胞激活，细胞应重悬于完全培养基中，浓度为(1-3)×10⁶Cells/mL。对于24孔板，推荐浓度为1×10⁶Cells/mL。

三、刺激培养

1. 在V型管中准备完全补充的T细胞培养基，向第二步中的细胞悬液中加入以下细胞因子和抗体：5 µg/mL抗人CD28单克隆抗体（

92674ES），10 ng/mL重组人IL-2蛋白（92674ES）

2. 将所需量的细胞转移到合适的细胞培养板中，最终密度为(1-1.5)×10⁶Cells/mL/cm²。

3. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。

第四步：细胞计数

1. 培养2天后，检查细胞的健康状况并记录图像。

2. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀。

3.. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于0.5mL 1%牛血清白蛋白（36101ES）中，计数细胞。检测细胞活性，要求活性>95%。

第五步：流式分析

激活标志物：CD69和CD25。

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该套装共包含3种试剂：

重组人IL-2：促进激活后T细胞的克隆扩增、维持活性与功能（如CD8⁺杀伤、CD4⁺辅助）

重组抗人CD3抗体：结合T细胞表面CD3/TCR复合物，启动T细胞激活的核心信号，替代抗原-MHC复合物刺激

重组人抗人CD28抗体：结合T细胞表面CD28，提供必需共刺激信号，避免T细胞失能（anergy），显著提升增殖与存活能力

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