做小鼠脾细胞多色流式，CD3/CD4/CD8抗体怎么搭配荧光素不干扰？

Canto II只有488/633，建议就用最经典的三色：CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC。FITC和PE之间确实有补偿，但这两个通道在488激光下信号强，单染管做准后补偿一般在20%以内，Diva自动补偿能处理。不要为了躲FITC/PE上PerCP-Cy5.5或APC-Cy7，这台机器通道数和补偿复杂度反而增加。每管10^6细胞按50 μL体系染，抗体先按说明书推荐量做预实验，记得同时准备补偿微球或单染细胞。预算有限时可先不买同型，FMO更实用。

如果50 test预算有限，优先保证CD4和CD8的荧光亮度，因为这两个决定分群；CD3可以选FITC或PerCP，但FITC便宜且克隆多。买之前问代理商有没有试用装或小包装，有时5 test或25 test的试用装能先跑通条件。另外Canto II 488/633配置下APC通常很稳定，可以把CD8放APC，避免与PE补偿。脾细胞做CD3/CD4/CD8通常分群明显，不一定需要同型对照，把FMO管留出来更值。

50 test小包装做预实验基本够，但要提前算好管数。三色方案需要至少3个单染管、1个空白管、几个FMO管和样本管；如果每个样本重复3次，总共可能要12-18管。50 test按1次/管算能覆盖，但如果你还要做抗体滴定就偏紧。建议预实验时单染管用补偿微球或把细胞数减半，染色体系降为50 μL，抗体按比例减少但别低于0.25 μL/管以免误差太大。正式实验量大再买大包装。