重组小鼠IL-6刺激Raw264.7后p-STAT3信号弱，求推荐活性稳定的批次

另一个容易忽略的是Raw264.7代数、血清饥饿和裂解液。Raw264.7代数太高或培养过密会钝化，我会把细胞控制在P8以内，铺板密度60-70%再用0.5% FBS饥饿2-4小时，比不饥饿的背景低。裂解液加足量磷酸酶抑制剂，最好用含NaF、Na3VO4的配方，转膜后别过度洗。IL-6刺激前可以用纯培养基洗两遍。内毒素可疑时，平行加多粘菌素B或使用低内毒素水复溶，排除LPS干扰。

建议你把检测指标从Western换成更敏感的流式磷酸化或细胞裂解物ELISA做初筛，尤其p-STAT3弱的时候，Western动态窗口窄。如果坚持Western，一抗选CST 9145、兔单抗，4℃过夜，二抗别太高，显影梯度曝光。品牌上问供应商要小样做对比：同一板细胞，同一浓度梯度，旧批次、新批次、不同品牌一起跑，比在社区问单次体感可靠。进口稳定但贵、货期长；国产适合高频使用，前提是一次多囤同一批号。

我这边现在用国产货为主，主要看ED50和批次报告。买之前让厂家提供该批的CoA，看比活（ED50）和纯度，不要仅看毫克数。到货后用你手上的Raw264.7做一次p-STAT3剂量曲线，固定样品制备和曝光条件，拿旧批次做桥接；如果新批50 ng/ml才出条带，可以直接要求退换或用于非关键实验。货期方面国产很多有现货，3-5天可到；进口代理商常要2-4周。价格国产50μg大概几百到一千多，进口会更贵，具体要询价。

先别只盯着品牌，先排除内毒素和操作。Raw264.7对LPS非常敏感，IL-6如果内毒素偏高会让背景磷酸化或炎症状态改变，反而可能压缩梯度窗口。建议你要求供应商提供该批内毒素数据，优先选低于0.1 EU/μg、无载体或低内毒素批。配液后用低蛋白吸附管分装，避免反复冻融；同时做0.1、1、10、50、100 ng/ml加15/30分钟两点，不要只盯15分钟。我用过进口PeproTech/R&D，批间活性较稳；国产近岸、义翘也有小鼠IL-6，但批次间最好自己平行滴定一批。