小鼠脾细胞流式CD3/CD4/CD8抗体配色与用量咨询

配色并不是只看荧光是否冲突，还要考虑补偿和设门。建议同一批样本至少做三管单染补偿（CD3、CD4、CD8各自荧光），如果做BV或APC-Cy7串联染料，最好同时做FMO管确认CD4和CD8的设门边界。脾细胞中CD4和CD8相对分群明显，但CD4弱阳性单核/DC背景会干扰，FMO可以帮助排除。串联染料注意不要固定过夜，否则可能解偶联，导致APC-Cy7出现假阳性渗漏。

脾脏制备时先用70 μm滤网研磨，裂红后计数，活率最好>90%，死细胞多会明显增加非特异和背景。每管1×10^6细胞用100 μL染色体积没问题，但注意先Fc阻断，再加抗体cocktail，4℃避光30 min。抗体cocktail可按总样本+10%损耗预混，避免每管加样误差。染色后用含2%FBS的PBS洗一遍，最后重悬上机。如果当天来不及测，可用1%多聚甲醛固定后4℃避光，但不要超过24小时，且串联染料建议尽量新鲜上机。

小鼠脾脏表型做CD3/CD4/CD8，如果仪器只有488和640激光，经典搭配可用CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD8-PE，补偿主要在FITC-PE之间，脾细胞分群清晰时还比较好调；但若要做弱表达或加IL-17等，建议尽量用405激光的BV421/BV510。比如CD3-BV421、CD4-FITC、CD8-APC，或CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-APC、CD8-PE-Cy7。每管1×10^6细胞用100 μL体系够用，关键是抗体按test量先滴定，不要盲目加多。

厂家推荐的test量通常按1×10^6细胞/100 μL设计，常见为0.25 μg或5 μL原液/test，但不同品牌不同荧光有差异。建议拿到抗体后先做3-4点滴定：从厂家推荐的1倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍开始，看CD3+、CD4+、CD8+群体的染色指数。脾细胞染色前务必用CD16/32封闭，4℃避光30 min，洗涤一次；100 μL体系不要低于50 μL，否则细胞太浓会增加非特异。若背景高，可加2%FBS或BSA。

国内BD、BioLegend、Invitrogen/eBioscience常规克隆号如17A2、RM4-5、53-6.7常有现货，但像BV421、APC-Cy7等特殊偶联可能需要订货。一般现货3-7天，订货2-6周都有，下单前让代理确认国内仓库存和效期，不要只看目录。小包装试用装可以主动问区域销售，25 μg或测试装通常用于验证，有的品牌会提供试用，但需要课题组信息和用途说明，不是所有克隆都有。若着急，可先借其它实验室的分装做预实验。