用DTT处理小鼠脾细胞做流式，终浓度和孵育时间？

文献差异大是因为脾细胞表面二硫键还原程度、检测表位和活率要求不同。若你担心活率，我建议第一次实验用 2 mM、冰上 15 min 作为起点，不要室温长时间放。如果还原不够，再升到 5 mM，不要超过 20 min。脾细胞处理后可能比未处理更脆，离心转速可降到 300 g，吸上清时留一点，避免吸走细胞。

建议从低浓度短时间开始做梯度，别直接上 10 mM。我做过类似处理，通常 1–5 mM、冰上或室温孵育 10–20 min，10^6 个细胞用 100–200 μL 反应体积就够了。终浓度 10 mM 对脾细胞活率影响比较大，容易贴壁差、碎片多。可以设 0、1、2、5 mM 四组，同时加 7-AAD 或 PI 看活率，优先选目的表位能还原但活率能保持在 85% 以上的条件。

DTT 最好现配。母液分装 -20°C，临用前用无血清 PBS 或 FACS buffer 稀释到工作浓度，不要加到含血清培养基里长时间放，因为血清蛋白会消耗部分 DTT，还原效率不稳定。处理完用 3–5 mL 预冷 FACS buffer 洗 2 遍，300–400 g 离心 5 min，再去染抗体。若细胞容易结块，可加 0.5–1 mM EDTA 或少量 DNase I。

注意做流式时，DTT 洗涤后二硫键可能重新氧化，若目的表位依赖还原态，应尽快染色或考虑加烷基化试剂如碘乙酰胺固定。还要设不加 DTT 的对照，因为 DTT 本身可能改变非特异性结合或某些荧光抗体结合。活率染料要放在染色方案里，不能只看 FSC/SSC，脾细胞处理后碎片和凋亡细胞会增多，建议每个浓度都看活率和目的抗原阳性率。