小鼠脾细胞用这个凋亡试剂盒需要单独调补偿吗？

脾脏单细胞悬液的背景确实比多数细胞系高，主要是红细胞裂解不彻底、粘连和碎片。建议裂红后过 40 μm 滤网，离心洗两次，用不含 EDTA 的 PBS 或 buffer 重悬。上机先看 FSC/SSC，圈淋巴细胞主群，别把左下角碎片算进去。1×10^6 细胞染色通常够，但脾细胞很容易结团，建议计数时用台盼蓝确认活率；如果活率低于 70%，染出来的 Annexin V/PI 双阳性比例会偏高，这时候要结合未染和单阳管判断象限。

货期一般取决于代理有没有现货：常规规格如果代理备货，很多地区 1-3 个工作日能到；如果仓库没货需要从厂家调，通常 1-2 周，进口批次还可能受清关影响。建议下单前直接问销售要现货批号和效期，不要只看平台显示。50T 适合先做预实验和小样本，100T 单次成本通常更划算，但如果实验室用量不大，要注意开封后避免反复冻融，结合自己每月样本量再决定规格。

试剂盒里的 binding buffer 不是按小鼠或细胞系区分，通用性主要看离子条件。一般买来是 10× 或 5× 浓缩液，用去离子水按说明书稀释成 1× 即可，不需要针对小鼠单独调整浓度。关键是不要用 PBS 直接替代，尤其不要用含 EDTA 的胰酶消化液或裂红液残留，因为 Annexin V 结合磷脂酰丝氨酸依赖钙离子，EDTA 会螯合钙导致染不上。洗细胞时如果前面用了含 EDTA 的液体，最后一步一定要用 1× binding buffer 或含钙缓冲液再洗一次。

小鼠脾细胞做 Annexin V-FITC/PI 双染，补偿一定要用单阳管设，别拿细胞系参数直接套。脾细胞碎片、死细胞和自发荧光比多数传代细胞系高，所以除了未染管，FITC 单阳管和 PI 单阳管最好都用同一批脾细胞制备。FITC 到 PI 通道的补偿一般不大，但 PI 向 FITC 通道会有漏，需要看仪器。若担心背景，可用 FMO 对照帮助确定 PI 阳性阈值。1×10^6 个细胞做一管够用，前提是活率不差；要同时做未染和两个单阳，至少准备 3-4 管，细胞总数翻倍比较稳妥。