Techniques双荧光素酶报告基因检测系统

——更简便、更灵敏、更准确

自1990年萤光素酶生物传感器技术诞生，时至今日，萤光素酶报告基因的检测系统被广泛应用于细胞信号通路、siRNA/miRNA、免疫应答、药物筛选等研究。萤光素酶报告基因检测系统中具有代表性的是萤火虫萤光素酶报告基因和海肾萤光素酶报告基因，由于两种酶底物和发光颜色的区别，且在动物体内无内源性表达，使其在单、双报告实验中得到广泛应用。

萤火虫萤光素酶是一种胞内蛋白，大小为61KDa。在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化底物萤火虫萤光素氧化，生成氧化萤光素，并发出黄绿色光，其最强发光波长为560nm。

海肾萤光素酶也是一种胞内蛋白，大小为36KDa。只需要氧气就可以催化腔肠素，氧化生成高能产物coelenteramide，并发出蓝光，其最强发光波长为465nm。

对于萤光素酶的化学发光与检测模式上存在以下差异：

» 化学发光根据发光的形式和种类分为闪光型（flash-type）与辉光型（glow-type）两种类型；

» 在检测方法上分为非均质检测与均质检测；

那么在萤光素酶检测实验中如何进行报告基因检测试剂的选择呢？接下来让我们一探究竟~

1 闪光型与辉光型差异

2 非均质型与均质型差异

»非均质型

优势：可留样检测（裂解液可保存用于后续检测）；劣势：操作繁琐。

» 均质型

优势：操作简单（裂解检测仅需一步）；劣势：不可留样检测。

好啦！以上说了这么多，相信大家已经明确了自己的需求啦~

翌圣生物提供“非均质法闪光型”和“均质法辉光型”萤光素酶检测试剂，大家可以根据单、双萤光素酶报告基因进行选择~

1 非均质闪光型报告基因检测（货号：11401、11402）

» 产品特点

裂解能力更强：能够彻底裂解绝大部分种类细胞。

信号更强：能够精准检测弱启动子的表达。

灵敏度更高：可检测低至10‐20摩尔萤光素酶分子。

线性范围更广：线性检测范围超过酶浓度的8个数量级。

» 应用方向

精准测量转录调控，miRNA靶基因验证，信号通路，转录因子和启动子研究等。

» 适用样本

哺乳动物细胞、原生质体、烟草叶片

» 数据展示

荧光强度媲美进口品牌

图1. Yeasen（货号：11402）荧光强度与P品牌相当，可完美替换进口品牌。

信号检测更强，淬灭彻底

图2. Yeasen（货号：11402）检测试剂和萤光素酶相互作用，可获得较佳的发光强度，加入海肾萤光素酶底物后，萤火虫萤光素发光淬灭情况：基本能够完全淬灭。

2 均质型辉光型报告基因检测（货号：11404、11405）

» 产品特点

信号稳定：半衰期长（达2h），非常适用于高通量检测，再也不用担心萤光信号淬灭的问题。

操作简便：只需要加样-读值，即可完成实验，挤出更多时间发paper。

准确度高：我有海肾萤光素酶的底物——腔肠素，可校正孔间细胞数量、转染效率的误差。

兼容性好：可用于多种常用细胞培养液，如RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等。

无刺激性气味：还你一个清新愉快的实验室环境。

» 应用方向

Fc effector检测系统，信号通路，免疫检查点检测系统( immune checkpoint assays)，细胞因子、生长因子检测和抗体内化研究的检测系统等。

» 适用样本

哺乳动物细胞、原生质体

» 数据展示

荧光强度和稳定性媲美进口品牌

图3. Yeasen（货号：11405）荧光强度和稳定性与P进口品牌相当。

淬灭效果与进口品牌相当

图4. Yeasen（货号：11405）检测试剂和萤光素酶相互作用，可获得较佳的发光强度，加入海肾萤光素酶底物后，萤火虫萤光素发光淬灭情况，淬灭效果与P进口品牌相当。

在不同培养基上能正常发光，且发光效果差异小于P进口公司

图5. Yeasen（货号：11405）在常用培养基：DMEM、F12、MEMα、RPMI-1640中都可以正常发光，并且不同培养基中的发光效果差异小于P进口公司。

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Q1：双萤光素酶报告基因最适反应温度？

A：室温（20-22℃）。反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。此两种萤光素酶的反应速率是受温度影响的，为了保证实验的一致性，我们推荐此两种工作液在检测时都孵育至室温。

Q2：双萤光素酶报告基因载体该如何选择？

A：1）萤火虫萤光素酶建议选取pGL-3或pGL-4或者自己构建的载体。。

2）海肾萤光素酶建议选取pRL-TK或pGL-4载体或者自己构建相应的载体。建议优先选用中等强度的启动子（如TK），而不使用强启动子（如SV40、CMV），以免影响主报告基因的表达，或进行实验摸索选择合适的载体。

Q3：检测的荧光数值很低怎么办？

A：检测的荧光数值很低说明细胞裂解液中的萤光素酶含量很低。通常解决办法为

1）转染的质粒采用细胞转染级别的质粒抽提试剂盒抽提。

2）优化转染条件，尽可能的提高转染效率。

3）增加实验的细胞量，并且裂解细胞时，适当减少细胞裂解液的量。

Q4：进行检测的过程中，荧光信号值太高该如何进行调整？

A：

1）在转染实验后，减少细胞的孵育时间。

2）降低荧光信号采集时间。

3）进行样品的稀释。

Q5：萤火虫萤光素酶读值和海肾萤光素酶读值的比例多少时比较合适？

A：尽量保证对照组的萤火虫萤光素酶的读值和海肾萤光素酶的读值接近，或者海肾萤光素酶的读值比萤火虫萤光素酶的读值稍高。对于具体的实验过程中，由于萤火虫萤光素酶质粒和海肾萤光素酶的质粒抽提的质量不一致，待检测目的调控元件的调控能力的不同等原因，一次实验很难达到一个比较好的实验结果，因此对于此实验，我们推荐预实验优化萤火虫萤光素酶质粒和海肾萤光素酶质粒的共转染量。

Q6：细胞培养、转染时使用96孔板还是6孔板或者其他规格的细胞培养板？

A：一般来说，如果能保证10%的转染效率，96孔板的细胞量就能够达到实验要求。如果细胞很难转染或者待检测的调控原件的调控作用很弱，可以增加实验的细胞量。

Q7：此试剂盒采用何种仪器和检测板检测比较好？

A：检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同；检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用，但因黑色会吸收光信号，可能会降低信号。