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应用方向免疫荧光实验全流程解决方案

📂 蛋白质研究类型 ID 5003

👁 23,005 次浏览 🗓 2026-10-09 源站内容 ID：1950790595452526592

免疫荧光（immunofluorescence，IF），是一种将免疫学方法与荧光标记技术相结合的实验技术。其基本原理是通过用荧光染料标记的抗体与待检样品中特定的抗原结合，通过荧光信号以检测蛋白质或其他生物分子进行定位、定性及定量的研究。免疫荧光技术具有高度的特异性和灵敏度，能够检测到微量的抗原或蛋白质。它广泛应用于细胞生物学、病理学、微生物学等领域，例如用于

来源：翌圣生物｜原文：https://www.yeasen.com/solutiondetail/1950790595452526592 ↗

免疫荧光（immunofluorescence，IF），是一种将免疫学方法与荧光标记技术相结合的实验技术。其基本原理是通过用荧光染料标记的抗体与待检样品中特定的抗原结合，通过荧光信号以检测蛋白质或其他生物分子进行定位、定性及定量的研究。

免疫荧光技术具有高度的特异性和灵敏度，能够检测到微量的抗原或蛋白质。它广泛应用于细胞生物学、病理学、微生物学等领域，例如用于研究细胞内蛋白质的定位、检测组织切片中的抗原分布、诊断疾病以及分析微生物感染情况等。

同时我司提供免疫组化全流程解决方案。

样本制备

1、细胞样本

贴壁细胞

1）取洁净的细胞爬片或大小合适的玻片，用5%稀盐酸浸泡过夜，纯水洗涤3次；

2）在70%乙醇中浸泡10-20 min后烘干备用；

3）先滴加少量培养基，再用无菌的镊子放置到细胞培养板/培养皿内；

4）胰酶消化贴壁细胞后，加入完全培养基，充分吹打至单细胞悬液，并调整至合适浓度（如1×10⁴~1×10⁵个/mL）；

5）将细胞加入带有无菌细胞爬片或玻片的细胞培养板/培养皿中培养；

6）待细胞状态良好且融合度达到50%-60%后，取出爬片或玻片；

7）吸去细胞培养液；

8）用适量PBS洗涤2-3次，每次3-5 s。

悬浮细胞

细胞甩片：

1) 取对数生长期细胞，弃去细胞培养液；

2) 加入适量PBS离心（350-400×g , 5 min）1-2次后重悬于PBS中；

3) 将载玻片固定于甩片机上；

4) 加0.1-0.5 mL细胞悬液至载玻片，迅速离心（1000-1200×g , 5 min）；

5) 取出载玻片，室温静置干燥。

细胞爬片：

1）取洁净的细胞爬片或大小合适的玻片，用5%稀盐酸浸泡过夜，纯水洗涤3次；

2）在70%乙醇中浸泡后10-20 min后烘干备用；

3）将合适浓度的细胞悬液直接滴在玻片上，根据细胞生长状况，适时（一般为24 h）取出爬片/玻片;

4）弃去细胞培养液，加入适量PBS洗涤2-3次，每次3-5 s；

5）室温静置干燥；

如果细胞的粘附能力不佳，可用多聚赖氨酸或者明胶预处理玻片表面5-10 min，用适量PBS洗涤后，干燥2-3 h即可使用，以促进细胞的贴壁生长。

2、组织样本

石蜡切片：是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好。

石蜡切片固定前需要进行脱蜡水化：

1) 将石蜡切片浸泡二甲苯中脱蜡5 min，再换用新鲜的二甲苯浸泡脱蜡，共脱蜡3次，每次5 min，以确保石蜡被完全去除；

2）无水乙醇洗涤2次，每次5 min；90%乙醇洗涤2次，每次5 min，70%乙醇洗涤1次，每次5 min，蒸馏水洗涤2次，每次5 min。

冷冻切片：制片速度快，对抗原影响较小。

石蜡切片固定前需要进行室温平衡：

1）将盛有组织切片的载玻片在30-37℃放置20-30 min；

2）复温后可直接进行固定步骤。

产品详情

产品编码	产品名称	规格
36309ES	OCT冰冻切片包埋剂（进口原料）	118mL
41403ES	PBS (1×) 细胞培养级	500 mL
41404ES	PBS (10×) 细胞培养级	500 mL
40108ES	Gelatin, Type A A型明胶	100g
60715ES	Poly-D-lysine 多聚-D-赖氨酸 (分子量:150000-300000)	5mg/10 mg/50 mg
60716ES	Poly-L-lysine 多聚-L-赖氨酸(分子量:150000-300000)	5mg/10 mg/50 mg

固定

固定剂主要通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用，能使细胞内物质尽量保持其生活状态时的结构和位置，其选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用。

1）加入适当4%多聚甲醛固定液进行室温固定，细胞固定时间10-15 min，组织切片固定时间15-20 min；

2）固定结束后立即用免疫染色洗涤液（一般为PBS或TBS）洗涤1-2次，每次3-5 min。

产品详情

产品编码	产品名称	规格
60535ES	10%中性福尔马林溶液	100 mL/500 mL
60536ES	4%多聚甲醛固定液	100 mL/500 mL
41403ES	PBS (1×) 细胞培养级	500 mL
41404ES	PBS(10×)细胞培养级	500 mL
60157ES	1x TBS Buffer，TBS 缓冲液(粉末)，PH 7.4,1L	10包/袋/50包/盒

抗原修复

我司的改进型柠檬酸钠抗原修复液能够更有效去除因使用多聚甲醛、甲醛等醛类试剂固定后导致蛋白间的交联，并充分暴露样品中的抗原表位，从而改善免疫染色效果，获得的染色信号更强，背景更低。

1）将切片浸泡在1×改进型柠檬酸钠抗原修复液中，95-100℃加热约20 min，（加热时间可以控制在10-30 min内，最佳加热时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索）；

2）冷却至室温，大约为20-30 min；

3）用免疫染色洗涤液（一般为PBS或TBS）洗涤1-2次，每次3-5 min。随后即可进行封闭等后续的免疫染色步骤。

产品详情

产品编码

产品名称

规格

36319ES

Improved Antigen Retrieval Buffer (50× Citrate Sodium Buffer, pH 6.0)

改进型柠檬酸钠抗原修复液（50×）

100 mL

通透

如果靶蛋白位于细胞内，对细胞进行通透处理尤为关键，其有助于暴露抗原、核酸等作用靶点，使抗体、探针或标记物等更容易进入细胞内，从而确保染色等的检测效果。通透剂包括：Triton X-100 或Digitonin或 Saponin。目前，Triton X-100是最常用。

1）切片样品：在固定、洗涤结束后，加入50~100 μL/片或者完全浸没在染色缸中；

细胞样品：在固定、洗涤结束后，按照六孔板每孔加入1 mL作为参考比例加入；

2）室温孵育5-10分钟，即可完成通透；

3）用PBS洗涤3次，每次2-3 min。

注：

1、对于较难通透的样品或者要求通透特别充分的情况，可以室温孵育10-30分钟。

2、用丙酮固定的样品不需要进行通透处理。

3、Triton X-100会破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜抗原。

产品详情

产品编码	产品名称	规格
36317ES	Immunostaining Permeabilization Buffer with Triton X-100 免疫染色通透液(Triton X-100)	100 mL/500 mL
54004ES	Digitonin洋地黄皂苷	25 mg/100 mg
60386ES	Saponin from Quillaja Bark 皂素，来源于皂树皮	5 g/25 g

封闭

加入免疫染色封闭液，一般封闭约60分钟，也可根据具体情况针对调整封闭时间，15-120分钟不等，对于背景非常高的抗体可以4℃封闭过夜。封闭时，可以放在摇床上缓慢摇动来提高封闭效果。如果样品摇动时容易脱落，也可以静置封闭，效果略有降低，但是不影响正常封闭。

产品详情

产品编码	产品名称	规格
36320ES	Immunostaining Blocking Buffer 免疫染色封闭液	100 mL
36128ES	Protein free rapid blocking buffer(1×) 无蛋白快速封闭液（1×）	100 mL/500 mL
36116ES	Normal donkey serum 正常驴血清（进口原料）	1 mL/10 mL
36117ES	Normal rabbit serum 正常兔血清（进口原料）	1 mL/5 mL
36118ES	Normal mouse serum 正常小鼠血清（进口原料）	1 mL/5 mL
36119ES	Normal goat serum 正常山羊血清（进口原料）	1 mL/10 mL

一抗孵育

抗体的选择，选择已通过验证可用于免疫荧光（IF）应用的一抗，来识别靶点；即可选择直接带有偶联物的一抗又可以利用普通的一抗识别靶点，然后再利用带有偶联物的二抗进行识别一抗。

1）根据一抗抗体说明书，按适当比例浓度用免疫染色一抗二抗稀释液（如1:100-1:500）稀释一抗。

2）吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗溶液，缓慢摇动孵育，4℃过夜（或室温1-2h）。

3）注意避光操作，避免荧光猝灭。

4）孵育结束后，回收一抗。

5）加入免疫染色洗涤液，洗涤3次，每次5 min，以去除未结合的抗体。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

产品详情

细胞器	作用位点/原理	产品编码	产品名称
细胞核	核膜内侧核纤层	38018ES	Lamin A/C Rabbit mAb
	核膜内侧核纤层	30003ES	Lamin B1 Mouse mAb
	核膜	38530ES	Emerin Rabbit mAb
	染色质	30005ES	Histone-H3 Mouse mAb
	染色质	31107ES	Histone H2A.X Rabbit mAb
	核仁	38722ES	Fibrillarin Rabbit pAb
	细胞增值性标记	30002ES	PCNA Mouse mAb
细胞膜	ATP1A1是水解ATP驱动钠和钾的转运的跨膜蛋白	38262ES	alpha 1 Sodium Potassium ATPase Rabbit mAb
细胞膜	ATP1A1是水解ATP驱动钠和钾的转运的跨膜蛋白	31108ES	alpha 1 Sodium Potassium ATPase Rabbit pAb
内质网	内质网膜/腔	38365ES	P4HB Rabbit mAb
	内质网腔	30051ES	GRP78/BIP Mouse mAb
	粗面内质网	31293ES	Calnexin Rabbit pAb
线粒体	线粒体基质	38054ES	HSP60 Mouse mAb
	线粒体膜间隙	30049ES	Cytochrome c Mouse mAb
	线粒体膜间隙	38148ES	AIF Rabbit mAb
	线粒体内膜	30006ES	COXIV Mouse mAb
	线粒体外膜	30065ES	TOMM20 Rabbit pAb
	线粒体外膜	38489ES	Hexokinase I Rabbit mAb
细胞骨架	微管	30301ES	β-Tubulin, Mouse mAb 小鼠抗β-Tubulin单克隆抗体
	微管	30302ES	β-Tubulin, Rabbit pAb 兔抗β-Tubulin多克隆抗体
	微管	30304ES	α-Tubulin, Mouse mAb 小鼠抗α-Tubulin单克隆抗体
	微丝	30102ES	β-actin, Rabbit mAb 兔抗β-actin单克隆抗体
	中间纤维	30021ES	Vimentin Mouse mAb
高尔基体	顺面	38971ES	GM130 Rabbit mAb
溶酶体	溶酶体膜	38013ES	LAMP1 Rabbit pAb
过氧化酶体	过氧化酶	38160ES	Human Catalase Rabbit mAb
内涵体	早期内体	38965ES	Rab5 Rabbit mAb
	晚期内体	31452ES	Rab7 Rabbit mAb
	晚期内体	38219ES	Rab9 Rabbit mAb
自噬体	SQSTM1/p62是与泛素结合的蛋白，P62可介导泛素化蛋白通过自噬体降解，与LC3 相互作用	30043ES	SQSTM1/p62 Rabbit pAb
外泌体	肿瘤易感基因101(TSG101)和白细胞分化抗原(CD9)都是外泌体的良好标志物	31512ES	TSG101 Rabbit mAb
		30010ES	TSG101 Rabbit pAb
		31514ES	CD9 Rabbit mAb
		30039ES	CD9 Rabbit pAb
细胞连接	在病理状态下，EpCAM集中表达于细胞间紧密连接处	31444ES	EpCAM Rabbit mAb
细胞连接	N-cadherin是一种钙依赖的单链跨膜糖蛋白，主要介导细胞的同型和异型粘附	38927ES	N Cadherin Mouse mAb

表格仅展示部分，详情请查阅翌圣官网产品中心。

二抗孵育

1）根据二抗抗体说明书，按适当比例浓度用免疫染色一抗二抗稀释液（如1:100-1:500）稀释二抗，避光。

2）吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，荧光标记的二抗注意室温避光孵育1h。

3）孵育结束后，回收二抗。

4）加入免疫染色洗涤液，洗涤3次，每次5 min以去除未结合的二抗。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

产品详情

产品编码	产品名称	规格	参考
33106ES	YSFluor™ 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	100 μL	二抗选择指南
33206ES	YSFluor™488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	100 μL
34213ES	YSFluor™ 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	100 μL
34912ES	YSFluor™594 Donkey Anti-Sheep IgG (H+L)	100 μL
33113ES	YSFluor™647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	100 μL
36323ES	免疫染色用一抗二抗稀释液	100 mL

表格仅展示部分，详情请查阅翌圣官网产品中心。

复染、封片

1）加入0.5-10 μg/mL DAPI或Hoechst核染色剂，室温孵育5-10 min，避光操作；

2）用PBS洗涤3次，每次5 min；

3）滴加一滴Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂至载玻片，盖上盖玻片，避免形成气泡，并可用无纺纱布轻轻按压盖玻片以去除多余分封片剂和封固盖玻片。

4）室温下避光静置5 min，使得封片剂晾干后再进行显微镜检测。

封片后，样本避光低温条件下保存，建议尽快进行显微镜观察。若玻片样本需长久保存，可使用指甲油或者中性树胶对盖玻片四周进行密封。

我司有含DAPI抗荧光淬灭封片剂，可同时完成核染和封片，使得实验操作更简便。

产品详情

产品编码	产品名称	规格
36307ES	Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂（水溶性）	5 mL/25 mL
36308ES	DAPI Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂（含DAPI，水溶性）	4 mL/20 mL
40727ES	DAPI 4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐	10mg
40728ES	DAPI Solution DAPI染液（5 mg/mL）	1mg (200μL)
40730ES	Hoechst 33258 染液（1 mg/mL）	1 mL
40732ES	Hoechst 33342 染液（1 mg/mL）	1 mL
40744ES	Hoechst 33342/PI 双染试剂盒	1 Kit（100 T）

翌圣最新提供免疫组化多重荧光染色，相关产品信息如下：

TSA试剂盒原理

酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术的核心机制，在于利用辣根过氧化物酶（HRP）在过氧化氢存在下，催化荧光标记的酪胺分子转化为高活性中间体，瞬间共价结合到目标蛋白周围的酪氨酸残基上，形成大量荧光素沉积，从而实现信号级联放大。

与传统的直接或间接荧光法相比，TSA技术可将信号灵敏度提升10至100倍甚至更高。翌圣mIHC试剂盒通过TSA技术结合抗体洗脱，清除切片上结合的一抗、二抗体系，同时保留稳定结合的荧光信号，再搭配不同光谱的荧光酪胺试剂重复反应流程，最终实现同一样本的多指标、多通道荧光叠加检测。

TSA产品优势

节省抗体：信号放大，一抗用量大幅减少
超高灵敏：弱表达靶点能轻松检出
种属不限：同种属一抗通用，仅搭配单一HRP标记二抗即可完成多标染色
信噪比高：染色背景低，目标信号稳定清晰
设备兼容：普通荧光显微镜或共聚焦显微镜即可检测，无需特殊仪器

TSA产品应用

★ 实验类型：广泛适配免疫组化IHC、免疫荧光ICC等主流实验技术

★ 适用样本：石蜡组织切片、冰冻组织切片、细胞爬片（冰冻切片、细胞爬片需要配合抗体洗脱液【推荐36216ES】使用）。

★多重染色：有效规避多重染色过程中的信号串扰问题，支持单标、双标、三标及以上超多重荧光染色检测。可在同一张组织切片上完成多靶标原位定位与共定位分析，清晰呈现不同蛋白的空间表达分布

相关产品详见下表，更多产品详情请点击TSA信号放大试剂盒让微弱信号清晰可见！

货号	产品名称	产品规格	目录价
36370ES	Multiplex Fluorescent IHC Dual-Color Kit 多重荧光免疫组化单标双色试剂盒（TSA即用型）	50 T	1150
		100 T	1750
36371ES	Multiplex Fluorescent IHC Three-Color Kit 多重荧光免疫组化双标三色试剂盒（TSA即用型）	50 T	1785
		100 T	2785
36372ES	Multiplex Fluorescent IHC Four-Color Kit 多重荧光免疫组化三标四色试剂盒（TSA即用型）	50 T	2485
		100 T	3585
36373ES	Multiplex Fluorescent IHC Five-Color Kit 多重荧光免疫组化四标五色试剂盒（TSA即用型）	50 T	3685
		100 T	5785
36374ES	Multiplex Fluorescent IHC Six-Color Kit 多重荧光免疫组化五标六色试剂盒（TSA即用型）	50 T	5285
		100 T	7685
36375ES	Multiplex Fluorescent IHC Seven-Color Kit 多重荧光免疫组化六标七色试剂盒（TSA即用型）	50 T	6485
		100 T	9885

免疫荧光常见问题及解决方案

问题	可能原因	方案建议
背景高	一抗浓度过高	预实验测试，找到抗体最佳工作浓度
	一抗变质、质量差的多克隆抗体	注意抗体的有效期，使用新抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
	二抗非特异性结合	只加二抗作为对照组
	洗涤不足	充分洗涤，适当增加洗涤次数
	封闭不充分	延长封闭时间或者更换封闭液
	抗体孵育时间过长或温度较高	严格按照实验操作流程实施
	样本干燥	使用湿盒和免疫组化笔
荧光无信号或信号弱	抗原丰度低	更换样本，增加阳性对照
	激发波长错误	确保激发波长与荧光基团激发波长相匹配
	一抗或二抗浓度低	提高一抗或二抗工作浓度
	一抗或二抗孵育不充分	一抗或二抗充分孵育
	未进行抗原修复/抗原修复不充分	进行抗原修复/延长抗原修复时间
	一抗二抗不兼容	注意抗体种属问题
	固定不充分或过度	调整固定时间
	样本保存不当	使用新鲜样本/注意避光
细胞有自发光	使用戊二醇固定	在固定后，荧光染色前进行荧光猝灭，如果使用甘氨酸和NaBH₄等，染色前检查自发荧光
细胞有自发光	材料本身（如石蜡）有自发光	在固定后，荧光染色前进行荧光猝灭，如果使用甘氨酸和NaBH₄等，染色前检查自发荧光
细胞/组织形态破坏	组织切片从玻片上脱落或切片有气泡	适当增加固定时间
	组织切片撕裂或有褶皱	切割刀片不太锋利，考虑重新切片
	细胞或组织固定不充分，自发裂解	适当增加固定时间，使用交联性固定剂

来源与原文

来源： 翌圣生物

原文链接： https://www.yeasen.com/solutiondetail/1950790595452526592

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