Spike in作为NGS实验的校正工具，在NGS技术中早早就有应用，像常见的RNA-seq中就有spike in。当然，最初，spike in是由ERCC（External RNA Control Consortium）RNA外部质控组织为RNA-seq开发的，以标化不同样本之间的RNA counts（通过与已知浓度的对照进行比对，借助RNA测序的方法对基因表达进行定量分析）。

在DNA-蛋白互作领域，spike in也被借鉴。像传统的DNA－蛋白互作技术ChIP-seq中引入果蝇基因组作为spike in来校正实验。当然，spike in引入后，效果也是十分明显的。spike in添加后，之前因PCR循环或测序偏好性影响而未检测到的表达差异基因在spike in normalization后，显示出明显的表达差异。

图1.ChIP-seq实验中spike in添加的优势（From David A et al. 2014. Cell Reports）

作为DNA-蛋白互作尤其是组蛋白修饰研究的新兴技术，CUT&tag的出现引发了一波表观热潮。尤其是其属于细胞内的原位实验，相较于ChIP-seq来说，优势明显。CUT&tag实验无需甲醛交联（对于一些结合较弱的转录因子，可以进行轻微甲醛交联）和超声片段化，这无疑降低了实验的门槛。CUT&tag实验利用了Tn5酶的特性，在转座切割时，原位切割的DNA上会携带Tn5酶的核心序列。进行文库构建步骤时，含有Tn5酶核心序列的接头能够直接连接和扩增就能将目的蛋白特异性抗体靶向结合DNA序列直接扩增成文库，无需繁琐的末修、加A和接头连接等步骤。

更重要的是，Tn5酶的使用，使得CUT&Tag能较好的应用在高通量单细胞表观研究中。目前已经有成熟的偶联含Tn5酶核心序列的Gel beads投入使用，我们进行常规CUT&tag实验后，进行单细胞捕获环节，gel beads上的核心序列会与细胞内特异性酶切DNA进行偶联，最后，通过常规的Tn5酶切建库的方式进行文库扩增，扩增后的序列会携带barcode进行细胞标记，从而实现单细胞CUT&tag研究。

图2.scCUT&tag实验流程，from Steven J. W. et al, 2021, Nature Biotechnology

Spike in在CUT&tag实验中进行实验校正，也是得到了CUT&tag实验流程的创造者Henikoff实验室的认可，Henikoff实验室也提供了spike in的标准分析流程。

翌圣生物创造性得在CUT&tag实验中，传承了spike in的优势，在CUT&tag实验中，加入三段不同长度的λDNA组成spike-in mix，恒量spike in的加入，让你的qPCR结果不受投入量影响，定量更准确。

图3.翌圣CUT&Tag试剂盒中spike in的测序结果

Spike in加入后，进行文库构建，建库前spikein-1：spikein-2：spikein-3=1：3：10，文库构建后，比例变化不大。对建库前的spike in和建库后的spike in进行回归方程计算，发现建库前和建库后的spike in呈现线性变化，R的平方值都达到0.99以上，表明spike in的加入，可以当作内参让建库后的DNA能够进行标准化校正。

CUT&tag实验中的spike in存在，优势广泛，它可以更准确的校正样本测序的reads，让样本间的差异直观的展示。

图4.不同投入量细胞的spike in校正

从上图可以看到，不同投入量的细胞在实验室，捕获到的测序reads是有差异的，引申来看，同一样本，不同处理间，也会出现这种差异，使用同一标准的spike in校正后，微弱差异的reads或者说微弱差异基因的信息才不会被测序等因素影响而淹没。

除了生信分析层面的差异，CUT&tag-qPCR也是很多老师会选择的实验方式，在CUT&tag-qPCR中，spike in的存在也是优势十足。

图5.不同投入量细胞的CUT&tag-qPCR spike in校正的结果

CUT&tag-qPCR时，用spike in校正后，可以很明显看到，如果没有spike in校正，不同投入量细胞进行CUT&tag实验，同一基因qPCR后富集倍率差异较大，但是spike in校正后，基因的富集倍率受投入量影响较少。另外，在CUT&tag实验中，一些低富集的基因，可能因实验因素导致CUT&tag-qPCR显示不富集，但是spike in校正后，低富集的基因显示出富集，并且真实展示了该基因确实是低富集。

当然，在CUT&tag实验中，spike in添加后，会在文库中呈现出来，大家如果碰到文库中有明显的400多bp大小的片段，一定不要惊讶为什么（spike in 3长度300 bp，再加上测序接头138 bp左右，大小就在400多bp）。

图6.CUT&tag实验阴性对照组IgG组spike in的文库峰

翌圣CUT&tag试剂盒，已经成功在不同的样本中以及不同的抗体中实验，下面展示一些客户的真实案例：

人外周血（H3K4me1）人肿瘤组织（H3K4me1）

人肿瘤组织（H3K27ac）人肿瘤组织（JUN）

桃果实（H3K27ac） HEK293细胞（GFP）

293T细胞（H3K27me3） U251MG细胞（H3K27me3）

Hela S3细胞（RNA polymerase II） 小鼠肝（H3K27me3）

HUH6细胞（β-Catenin） A549（BDR4）

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