应用方向DNA文库制备 | 大刺鳅\牡蛎\扇贝\小龙虾水产样本全基因组测序
实验所用试剂清单类别货号产品名称DNA建库12972ESHieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4磁珠12601ESHieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠定量12642ES1
实验所用试剂清单
类别 | 货号 | 产品名称 |
DNA建库 | Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4 | |
磁珠 | Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 | |
定量 | 1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂 | |
接头 | Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set4（1152种Illumina双端唯一接头，板式接头，set4） | |
自备材料 | — | 无水乙醇 |
实验前准备
1、磁珠使用前应先平衡至室温；
2、配制80%乙醇
3、接头4倍稀释。
4、按照下表中的量准备样本。
实验编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
物种 | 大刺鳅 | 大刺鳅 | 大刺鳅 | 牡蛎 | 牡蛎 | 牡蛎 | 扇贝 | 扇贝 | 扇贝 | 小龙虾 | 小龙虾 | 小龙虾 |
实验条件
建库方式 | 自动化设备建库AMTK ilab300 |
input | 500ng |
片段化 | 4℃ 1min，35℃ 15 min，72℃ 20min，4℃ hold |
Adapter | Illumina短接头，4倍稀释 |
连接后纯化、分选比例 | 连接后0.6×纯化、 分选0.65×/0.15× |
扩增循环数 | 7 cycles |
扩增后纯化比例 | 0.9×纯化 |
文库洗脱 | 23 μL |
操作步骤
一、DNA片段化/末端修复/dA尾添加 (DNA Fragmentation/End Repair/dA-Tailing)
将表1各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。参考表格反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。
表1.DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应
反应体系 | 反应程序 | ||
名称 | 体积(μL) | 温度 | 时间 |
Input DNA | 500 ng | 热盖105℃ | On |
Smearase®Buffer 4.0 | 10 | 4℃ | 1 min |
Smearase®Enzyme 4.0 | 10 | 35℃ | 15min |
ddH2O | Up to 60 | 72℃ | 20 min |
- | - | 4℃ | Hold |
二、接头连接 (Adapter Ligation)
需要根据Input DNA量稀释Adapter至合适浓度，本次使用的UDI接头稀释4倍。
将表2中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。参考表2设置反应程序，进行接头连接反应。
表2.接头连接反应
名称 | 体积(μL) | 温度 | 时间 |
dA-tailed DNA | 60 | - | - |
Ligation Enhancer4.0 | 30* | 热盖 | Off |
RapidDNA Ligase4.0 | 10 | 20℃ | 15 min |
PEAdapter | 5 | 4℃ | Hold |
ddH2O | Up to 110 | - | - |
【注】：*LigationEnhancer比较粘稠，使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
三、连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)
该步骤使用磁珠对接头连接产物进行纯化。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
本次采用接头连接后先纯化再分选方案，连接产物先进行0.6×纯化，102 μL ddH2O洗脱后再按0.65×/0.15×比例分选，最终洗脱产物20 μL进行下一步扩增反应。
三、文库扩增(Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。参考表3进行文库扩增反应体系配制和程序设置。
表3.文库扩增反应
名称 | 体积(μL) | 温度 | 时间 | 循环数 |
Adapter Ligated DNA | 20 | 98℃ | 45sec | 1 |
2×Ultima HF Amplification Mix | 25 | 98℃ |
| 7 |
Primer Mix（12330ES） | 5* | 60℃ | 30 sec | |
Total | 50 | 72℃ | 30 sec | |
- | - | 72℃ | 1min | 1 |
- | - | 4℃ | Hold | - |
四、扩增产物磁珠纯化
扩增后产物使用Hieff NGS®DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)纯化。
质检结果
实验编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
物种 | 大刺鳅 | 大刺鳅 | 大刺鳅 | 牡蛎 | 牡蛎 | 牡蛎 | 扇贝 | 扇贝 | 扇贝 | 小龙虾 | 小龙虾 | 小龙虾 |
文库浓度（ng/μL） | 30.4 | 30.4 | 58.4 | 63.6 | 88.8 | 48.4 | 52.6 | 43.5 | 54.7 | 48.9 | 47.4 | 48.6 |
文库产量(ng) | 699 | 699 | 1343 | 1463 | 2042 | 1113 | 1210 | 1001 | 1258 | 1125 | 1090 | 1118 |
文库琼脂糖凝胶电泳图（Marker 最亮的条带为500 bp）
Qsep分析图（取1~4号样本进行Qsep分析）
实验结果分析
水产样本大刺鳅、牡蛎、扇贝、小龙虾采用酶切法建库试剂盒12972ES在AMTK ilab300建库，文库产量高，文库片段集中，满足质控标准。