Applications干货 | DNA Marker怎么选？

>覆盖片段范围广：100bp-12000bp；

>条带密集：涉及20个条带；

>指示明确：含3个指示带，各条带浓度已知，便于定位及半定量分析；

>背景干净、带型稳定、大小精准。

Marker条带模糊、拖尾、扩散

• 排查方向：Marker是否反复冻融？是否长时间置于室温或4°C？储存管是否污染了核酸酶？

• 解决方案：将Marker小剂量分装，避免反复冻融；使用后立即放回-20°C；确保使用无菌的枪头和离心管。

• 排查方向：琼脂糖是否完全溶解？凝胶是否有气泡或凝固不均匀？缓冲液是否陈旧或重复使用次数过多？

• 解决方案： 加热溶解琼脂糖后务必摇匀；倒入胶板前静置片刻让气泡逸出；使用新鲜配制的电泳缓冲液（TAE或TBE）。

Marker条带缺失、条带数量不对或强度异常弱

• 排查方向：特别是大片段条带缺失，很可能是物理剪切或核酸酶污染导致的大片段降解。

• 解决方案：使用新分装的Marker，操作轻柔。

• 排查方向：是否忘记加Marker？点样时是否戳破了加样孔导致泄漏？枪头内是否有样品？

• 解决方案：养成良好习惯，先加Marker，再加样品；点样时手要稳，枪头尖端轻轻伸入加样孔即可。

Marker条带扭曲、不整齐

• 排查方向：电压是否太高？电泳槽是否放在冰上或连接了冷却系统？

• 解决方案：降低电压；在冷室进行电泳或使用循环水冷却装置。

• 排查方向：凝胶表面是否平整？

• 解决方案：确保胶板水平，倒入融化的琼脂糖后让其自然凝固，避免震动。

未知DNA片段的大小与Marker比对后，和预期不符

• 排查方向：不同浓度的凝胶对DNA的分离范围不同。在高浓度凝胶中，小片段分离好，大片段迁移慢；低浓度则相反。

• 解决方案：根据目标片段大小选择合适的凝胶浓度，并确保在相同的条件下比较Marker和样品。

• 排查方向：使用的是TAE还是TBE缓冲液？

• 解决方案：TBE的缓冲能力比TAE强，对于分离小片段（<1 kb）效果更好，且DNA在TAE中的迁移速率比在TBE中快约10%。比较大小时应在同一缓冲系统中进行。

利用Marker估算的样品浓度不准

• 排查方向：是否选择了浓度相近的条带进行比较？不同片段长度的DNA与染料结合效率可能有细微差异。

• 解决方案：尽量选择与目标条带大小相近的Marker条带进行亮度比较。这只是半定量方法，对于精确定量，应使用分光光度计或荧光计（如Qubit）。

• 排查方向：Marker和样品的上样体积是否严格相同？

• 解决方案：确保使用同一把移液器，并且上样体积一致。