ApplicationsELISA试剂盒-酶联免疫吸附测定试验那点事

ELISA原理是将抗原或抗体包被在固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，检测过程中，通常使用洗板的方式去除非结合物，最终酶促反应后的底物的颜色，对样本中蛋白进行定性与定量。

1.抗体：单抗特异性强，多抗结合性高，高端试剂盒需要高效的配对。
2.抗原：大多为重组蛋白,细胞因子和待测样本，高效标准品需NIBSC/WHO校准。
3.显色作用体系：首先辣根过氧化物酶（HRP）与常见底物TMB和OPD均可形成显色体系，再者碱性磷酸酶(AP)的底物为对-硝基苯磷酸酯可形成黄色底物，还有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊显色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物为4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高强度荧光。

图1：ELISA常用试剂示意图

根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，按照原理及操作，市面最常用的方法有：

是检测抗体最常用的方法，原理为利用酶标记的二抗以检测已与固相结合的受检抗体，显色测定。优势在于待测一抗无需标记快速便捷。直接法ELISA与间接法ELISA相似，区别在于一抗酶标，检测孵育也以抗原为主，但直接法ELISA的灵敏度有限，需权衡使用。

图2：间接法ELISA示意图

又分为双抗原夹心法和双抗体夹心法ELISA，原理相似，用于检测抗体或抗原含量。以双抗体夹心法为例，捕获抗体包被在固相载体上，加入抗原或待测样本结合，后加入的检测抗体结合在抗原上，形成三明治夹心形式。双抗夹心法是市面最常见与方便分析的方法。

图3：双抗夹心法ELISA示意图

小分子抗原与半抗原的检测方法常用竞争法ELISA，待检样本中抗原越多，被结合的酶标抗原的量会减少，彼此形成竞争负相关体系，显色物质也就越少，根据显色物质的比例可拟合得到待测抗原含量。

图4：竞争法ELISA示意图

a.免疫抑制法测ELISA：固相包被抗原，被检样本对底物显色的抑制程度与样本中所含抗原的量成正比，二者之差为待测抗原含量，原理类似与竞争法ELISA。
b.阻断ELISA：目的检测特异性抗体，也称为竞争ELISA，原理为固相包被抗原，待测样本与一抗酶标竞争孵育，待检样本中抗体越多，显色越浅，反则反之。非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中涉及该法。
c.此外有用于检测IgM抗体的抗体捕捉ELISA，有固相载体改变的Dot-ELISA（硝酸纤维素膜）和C-ELISA（涤纶布），还有技术分类的TRFIA和多因子检测等。

ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：

ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：

a.回收率：测定试剂盒对数据真实性的校准，过高或偏低会产生加样和假性性的失准数据。
b.线性：测定试剂盒稀释液与样本微环境的的准确性，过高或偏低均会出现测定的偏差。

a.板内精确度：评价单次实验中，同一个已知浓度不同复孔的差异。
b.板间精确度：评价同一样本，多次实验的差异。

最低检测限：能显著区分空白信号的最小信号值对应的最低浓度，用于评估试剂盒的灵敏度，值越低试剂盒灵敏度越高。

对天然样本及合适的样本类型检测分析。对天然样本类型确定，避免假阳性或假阴性结果。

图5：ELISA试剂盒产品分类

ELISA技术是特定靶标蛋白质定量的金标准，提供快速，稳定且易于分析的结果。可以对生物大分子/小分子的定量，对亲和力测定评价或者筛选，还可对重组蛋白或细胞因子进行活性比对分析等运用。常应用于细胞因子，趋化因子，生长因子等检测，同时应用于癌症、干细胞、免疫学、神经学和信号转导等研究领域的靶标。

图6：ELISA的技术应用

在生物医药研究，细菌疾病和临床诊断中，ELISA作为成熟免疫的检测方法定量检测出所需研究的细胞因子，抗原等物质，应用十分广泛，了解ELISA并选择合适的试剂盒，会让研究事半功倍。

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