分子产品技术咨询FAQ

a)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。b）常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。

可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪…

13095有Low ROX，13152不含ROX，根据机型选择，都可以用在探针法SNP检测。

双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。…

可能原因：a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。b）交叉污染。c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。解决方案：a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。c）0通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值…

可能原因：存在大小相近的非特异性扩增解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

后续更换需要ROX的仪器可以额外加ROX进入反应体系。

不可以的，这款产品的适用方向是常规基因表达定量（mRNA/gDNA/质粒模板），未针对非编码 RNA 的特殊结构做引物体系和扩增策略优化。

有影响，预变性时间较长可能会影响酶的活性，导致 PCR 产物的产量有所降低。

里面预混的ROX浓度不同，需要根据仪器的型号进行对应选择。

有影响，预变性时间较长可能会影响酶的活性，导致 PCR 产物的产量有所降低。Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3--3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=…

有影响，预变性时间较长可能会影响酶的活性，导致 PCR 产物的产量有所降低。

酶不一样，11208 是可以做多重PCR，11205 只能做单重PCR，做qPCR 是没有问题的。

可以，但一般推荐 20ul。大体系减少误差。5μl 体系太小，加样误差会很大，不推荐。

建议在 300bp 以下，过长的产物会导致酶效降低。若一定要用，建议用三步法。

试剂中本身含有稳定性成分，本身不参与任何反应，稳定剂成分在电泳胶上面会表现出弥散状，不建议跑完后再电泳。

可以先混合大体系，再分别加到离心管里面，最后加模板；枪头加样不要把空气打进去，二档吸样，一档打样品；缓慢推出液体，不要吹打；沿着壁打入到孔内；另外配置完后，如果还有气泡，离心PCR管去除。如果是96孔板，移液完后轻轻敲96孔板。

沉淀是稳定剂冻存后溶解度下降析出形成的，不影响产品性能。建议解冻后上下颠倒，枪头吹打混匀至沉淀消失。若仍未溶解，可离心后取液体，请避免取到该沉淀。

试剂中本身含有稳定性成分，本身不参与任何反应，稳定剂成分在电泳胶上面会表现出弥散状，不建议跑完后再电泳。