无需特殊处理，但为了保证阳性率，最好进行胶回收纯化。
两者不建议混合使用。
不可以，TOPO 异构酶具有限制性内切酶活性，时间过长会重新切割重组质粒，建议反应时间不超过 5min。
a）验证过 5kb，一般片段越大，难度系数也会更高些。b）不能插入多片段，只能单个片段的插入。
都可以替代。①与全式金 TOPO 克隆的区别：a）全式金没有自杀基因，需要蓝白斑筛选，翊圣的有自杀基因， 不需要筛选。②全式金的组分带有通用引物和感受态细胞，翊圣不含有，客户需额外准备。与 Takara T 载体的区别：原理不一样，Takara 试剂盒利用的是 T4 连接酶，翊圣是 TOPO 异构酶…
不一致。短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头 PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的 DNA 文库。长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同 Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物Primer Mix 扩增完整的…
碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文 一文全面解析 NGS 接头的奥秘 ）
长接头带完整的 index 序列，所以接头连接的时候直接完成文库构建，此时如果文库浓度达到测序要求，那么可以直接PCR-Free 建库；短接头建库，接头连接步骤双端同时连接相同的 PE Adapter。序列如下：PE Adapter for Illumina：5 -/5Phos/ GATCGGAAG…
不是的，双端的 i5 端有 16 种 index，i7 端有 24 种 index，两者组合之后可以达到 384 种 index 组合.单端/双端 index 接头示意图如下：
不可以，Ligation Enhancer 内含高浓度的 PEG，会对分选造成显著影响，所以接头连接后如果进行片段分选必须先纯化。
插入片段的3' 末端与载体的5' 末端之间有一个缺刻，可在大肠杆菌中自动进行修复。
M-MLV (H-) Reverse Transcriptase 是通过对野生型 M-MLV 逆转录酶基因改造，在大肠杆菌中表达纯化而成。. 无 RNaseH 活性，具有合成能力高，热稳定性好和半衰期长的特点。
① 提升复杂模板的扩增能力：增强了对高 GC 含量、回文结构等复杂模板的延伸能力，使 NGS 测序覆盖度更加均一，降低所需测序深度，同时减少测序中的 Gap 区域，提高单细胞测序的数据质量与完整度。② 提高扩增产物产量与效率：在全基因组扩增（WGA）、多重置换扩增（MDA）及滚环扩增（RCA）等实验…
UniPhi29适用于所有需要phi29 DNA聚合酶链置换活性和持续合成能力的等温扩增实验，包括但不限于：• 滚环扩增（RCA）：环状DNA模板的线性/指数扩增• 多重置换扩增（MDA）：全基因组扩增（WGA），尤其是单细胞基因组扩增• 质粒体外酶促扩增（DNA酶法合成/dbDNA生产）• 锁式探…
两款都为突变过的phi29 DNA聚合酶，UniPhi29（14417ES）是在14404ES基础上升级而来，在大多数场景下表现更优，建议优先尝试UniPhi29。
UniPhi29 完整保留高活性 3'→5' 外切校对功能，扩增错配率远低于普通 Taq 酶；42℃高温体系减少模板二级结构导致的错配延伸，单细胞 WGA、RCA 扩增产物 NGS 测序 SNV 检测结果可靠，可用于低频突变、CNV 拷贝数变异分析。
提升反应温度至42℃；延长孵育时间，RCA 标准 4 h 可延长至 6 h；MDA 4 h 延长至 12–16 h；体系添加无机焦磷酸酶，解除焦磷酸产物对聚合酶的反馈抑制；小幅上调镁离子、硫代随机引物终浓度，梯度摸索最优区间；排查模板完整性，降解严重微量样本可适度提高模板投入量。
引物体系优化：下调硫代引物终浓度至 0.1–1 μM，检查引物是否存在分子内二聚体、3' 端错配；模板前处理：使用 Exo I+Exo III 消化未环化线性 DNA，消除线性模板引发的杂扩增；反应组分调整：dNTP mix降至 100–300 μM 区间，小幅降低镁离子浓度；外源污染排查：更换全新…
不可直接建库，必须完整预处理，三步缺一不可：热灭活终止反应：65℃孵育 10 min，彻底消除 UniPhi29 残留酶活，避免降解文库片段；磁珠纯化去除杂质：0.6–0.9× 磁珠两轮纯化，清除残留随机引物、dNTP、游离酶蛋白；片段化处理：超声或酶切打断高分子量分支 DNA 至 200–500 …
RCA产物的验证可通过以下方法：（1）限制性内切酶消化+琼脂糖凝胶电泳：在环状模板中设计单一切割位点，RCA产物经酶切后应产生均一长度的条带，可直观判断产物是否正确。这是最常用的验证方法。（2）荧光染料检测：使用SYBR Green或PicoGreen等dsDNA荧光染料，在反应体系中直接检测荧光信…