点突变过程需要去除模板质粒，防止假阳性。利用的原理就是限制性内切酶 DpnI 能消化甲基化的模板，若是非甲基化，则无法去除模板。
正反向扩增引物 5’端包含至少 20 bp 反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为 20 bp。互补区尽量选择无重复序列，GC 含量尽量在 40%-60%范围内。
在不影响扩增产物的情况下，尽可能少的量（建议＜1ng），避免DpnI 消化不完全。
最好进行胶回收。未消化完全的质粒或其他非特异性条带会影响后续的重组反应。
PCR 模板应为甲基化质粒，应使用甲基化酶无缺陷型的宿主菌扩增原始质粒（如DH5α，TOP10， JM109 等）。应尽量使用新鲜制备的质粒作为模板，因长期放置，反复冻融可能会导致模板质粒断裂，开环或降解。
小于 20 kb。质粒越大，其他非目的碱基的突变率越高，PCR 更难，重组效率更低。
多点突变试剂盒可一步实现目标质粒上 3-5 个不连续位点的定点突变，而定点突变试剂盒是适合 1 或 2 个不连续位点的定点突变。如：3 个连续的碱基突变算 1 个位点的突变，故定点突变试剂盒即可（相距超过 50 bp 为 1 个不连续位点）。
点突变过程需要去除模板质粒，防止假阳性。利用的原理就是限制性内切酶DpnI 能消化甲基化的模板，若是非甲基化，则无法去除模板。
a）PCR 模板应为甲基化质粒，应使用甲基化酶无缺陷型的宿主菌扩增原始质粒（如DH5α， TOP10，JM109 等）。b）应尽量使用新鲜制备的质粒作为模板，因长期放置，反复冻融可能会导致模板质粒断裂， 开环或降解。
正反向扩增引物 5’端包含至少 20 bp 反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为 20 bp。互补区尽量选择无重复序列，GC 含量尽量在 40%-60%范围内。
大于 5kb 连接成功的概率非常低，理论上不可以。
不可以，TOPO 异构酶具有限制性内切酶活性，时间过长会重新切割重组质粒，建议反应时间不超过 5min。
可以替代。区别：原理不一样，Takara 试剂盒利用的是 T4 连接酶，我们是 TOPO 异构酶，TOPO 异构酶更快更高效。
1）自杀基因 CCDB 是指无片段插入该基因中时，该基因会表达蛋白杀死细菌，使克隆无法生长，CCDB 基因的序列是保密的。2）CCCTT 序列是指拓扑异构酶能够偶联的序列。
不可以。试剂盒中含有偶连了拓扑异构酶的商业化载体，客户自己的载体没有偶连拓扑异构酶，无法直接连接。
后续需要改造质粒涉及到酶切就选购 10910，无这种需求的可以选购不含多克隆位点的产品。
不用酶切，直接连接就可以。
TOPO 克隆试剂盒都是 1.8kb，这个载体已经被修饰了，电泳跑出来会大于 2kb。
推荐氨苄抗生素浓度为100μg/ml。
应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。并且克隆位点上下游 20 bp区域内 GC 含量尽量在 40%-60%范围内。