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Q:10615ES酶法加帽中先升温再降温的目的是什么?在放大生产时好像很难做到先升温再降温。

先升温是为了把RNA二级结构打开,让RNA处于单链状态。如果不进行这步操作的话,会影响加帽的效率。这部分目前的确是工艺生产上的难点。现在有的公司直接在模板序列确定时会对RNA的二级结构作预测,加帽酶只识别mRNA前几个核苷酸,如果确定这部分结构不会产生RNA的二级结构的话,可以不进行加热。

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Q:10615ES帽类似物加帽和酶法加帽如何选择?

工业上酶法加帽最常使用的是牛痘病毒加帽酶处理IVT产物可以将其修饰成Cap 0 mRNA,Cap 0结构可以在二氧甲基转移酶(2'O-methyltransferase)的作用下进一步修饰成Cap 1(m7GpppmN)。利用酶法加帽,加帽效率可以达到95%以上。共转录加帽法操作简便,但由于GTP会…

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Q:10615ES加帽优化的方式有哪些?

通过增加VCE的量例如100ul体系加入10ul即100U的酶活,主要是增强VCE的甲基转移酶活性,也可以通过增加SAM(0.5mmol)增强鸟苷转移活性,增加加帽率。例如我们的新款单链加帽酶,它的加帽率显著提升,就是鸟苷转移活性比传统的更好,对于传统VCE,小亚基D12容易沉淀形成聚合物,纯化时容…

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Q:10615ES对于一些没有加上帽子的mRNA,会对后续实验比如说做生物制剂等有什么影响?

目前行业对这一块的没有做针对性的去除,行业里面主要是看加帽效率的多少,目前做的比较好的加帽率在80%以上,当然肯定是越高越好了。这个还没有一个绝对的标准。对于合成之后的mRNA,可以用纯化的方式处理,比如康*的一步膜包,极大的减少了纯化工艺,传统用Oligo d(T)的柱子做纯化,效果好可以回收率7…

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