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两款产品是同一个酶切位点的同工酶，15203ES酶切效果更好，但价格相对较贵。15048ES相对酶切效果弱于15203，并且属于温度敏感型，使用和保存要谨慎，性价比较高。

转化质粒的大小与菌株有关， DH5α和 Top10 感受态细胞适合小于 15kb 的质粒。

先用感受态细胞转到含抗生素的培养基中，如果不长，说明抗生素没有失效。在排除抗生素是否失效的原因后，检查转化步骤，在转化操作时，请勿将菌体全部涂布于平板上。因为大量菌体的存在抑制正常转化子的生长。改正的方法有两种：一是省去 37℃ 复苏培养的步骤，这样不但节省了时间，而且也不出现云雾了；二是 37℃复…

Amp 抗性板铺板密度过高或培养时间过长都会导致出现对 Amp 敏感的卫星菌落， 因此涂布 Amp 抗性板时菌密度应适当降低，同时 37℃培养时间不超过 20 h。另外推荐选择培养基中使用羧苄青霉素代替氨苄青霉素(Amp)，并将抗生素浓度提高到 100µg/mL，可使情况改善。

转化质粒的大小与菌株有关， DH5α感受态细胞适合小于 15kb 的质粒。

11802属于普通速度转化的感受态细胞，需要42℃热激37℃孵育等步骤，而11803属于快速转化的感受态细胞，无需热激孵育。

a）设计原则：同源臂（15-25 bp，GC 含量 40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物（常规插入片段扩增引物）。b）可以不引入。c）计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的 Tm 值，引入的同源序列及酶切位点不应参与计算。

应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。并且克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量尽量在 40%-60%范围内。

原因 1：载体线性化不完全判断方法：将已制备的线性化的载体转化涂板，如果长克隆较多，则表示线性化不完全。解决方案：若线性化不完全则需优化酶切体系，例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等，具体优化操作可参考限制性内切酶供应商的使用说明（通常推荐双酶切）。原因 2：反应体系中…

10922可组装片段最大可到23k，10923最大可至25k。另10923可做小体系低至6μL 。

采用载体通用M13引物，扩增出500多bp的条带。

氨苄和羧苄都可以，建议羧苄，因为氨苄失效比较快。

基于同源重组技术的定点突变系统。使用本试剂盒，目标质粒扩增产物经 DpnI 消化 同源重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。

多点突变试剂盒可一步实现目标质粒上 3-5 个不连续位点的定点突变，而定点突变试剂盒是适合 1 或2 个不连续位点的定点突变。如：3 个连续的碱基突变算 1 个位点的突变，故定点突变试剂盒即可（相距超过 50 bp 为 1 个不连续位点）。

点突变过程需要去除模板质粒，防止假阳性。利用的原理就是限制性内切酶 DpnI 能消化甲基化的模板，若是非甲基化，则无法去除模板。

正反向扩增引物 5’端包含至少 20 bp 反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为 20 bp。互补区尽量选择无重复序列，GC 含量尽量在 40%-60%范围内。

在不影响扩增产物的情况下，尽可能少的量（建议＜1ng），避免DpnI 消化不完全。

最好进行胶回收。未消化完全的质粒或其他非特异性条带会影响后续的重组反应。

PCR 模板应为甲基化质粒，应使用甲基化酶无缺陷型的宿主菌扩增原始质粒（如DH5α，TOP10， JM109 等）。应尽量使用新鲜制备的质粒作为模板，因长期放置，反复冻融可能会导致模板质粒断裂，开环或降解。

小于 20 kb。质粒越大，其他非目的碱基的突变率越高，PCR 更难，重组效率更低。