建议凝血酶母液用生理盐水配制,切割时的缓冲液最好加入0.9%的氯化钠,可以在4℃切割24小时。建议加入等量的消化缓冲液(推荐20mM Tris-HCl缓冲液,含150mM 氯化钠,pH8.0)
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如果在4℃切割不明显,可以尝试在37℃进行切割实验,每2小时补加适量的凝血酶,看看是否能有效切割。
用我们实验室的融合蛋白,每1mg融合蛋白加凝血酶5U,反应缓冲体系为20mM Tris-HCl 含0.15M 氯化钠,pH7.8,比较37℃和4℃的切割效果,反应时间4小时,两种温度条件下均可实现基本完全切割,在1小时和2小时,37℃切割效果明显较4℃好。4小时后两者差别不明显。
我们的凝血酶每1 KU中约含有凝血酶蛋白质0.5 mg,凝血酶1KU每支中干粉质量约30 mg,大部分为辅料。
一般建议一次用完。凝血酶产品为冻干粉末,溶解时,建议每支凝血酶加0.9%氯化钠溶液1~2 ml复溶,制成浓溶液,该浓溶液在-20℃以下保存,6个月内活性变化不显著,但应避免反复冻融。临用前,再用工作液稀释至终浓度。一般应避免使用纯水溶解和稀释,在纯水中凝血酶容易发生变性失活。
一般磷酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液都是可以的。
产品在常温下放置一周以内影响不大。
凝血酶可从切割产物中用苯甲脒或肝素琼脂糖亲和纯化移去。
据文献报道牛凝血酶的 PI是7.05。
该产品来源于大肠杆菌经过Ni 柱亲和纯化而来。
重组型 TEV 蛋白酶(rTEV)是经过基因工程改造和纯化后的重组蛋白酶,不仅保持天然 TEV 酶的功能活性,且在广谱的温度范围内表现出更强的稳定性和特异性。
rTEV 是一种用来切除融合蛋白上亲和标签的常用工具酶,具有很强的位点特异性。
该产品16-30℃下反应 3-3.5h 最好。
该酶分子量为27.5KD。
带his标签,酶切后可用Ni去除。
Buffer 1(10×)组分:5% SDS; 400 mM DTT;这两个成分在低温条件下都比较容易析出,内部做了测试的,不溶解的情况下,混悬均一吸取不影响反应效果。或选择在 50℃ 10min复溶后使用,也不影响酶活。
具体成分不方便告知,含有DTT,是在变性条件下的去糖基;酶切后蛋白没有活性了。
PNGase F的活性会被SDS抑制,所以反应溶液中必须有NP-40。 我们目前说明书NP-40建议量只是针对buffer1中的SDS的(1ul buffer1(5% SDS; 400 mM DTT)、2ul的10%NP-40) 如客户蛋白溶液中有SDS, 可以相应的多加点NP-40(参考说明书的比…
该酶效力高且待切蛋白结构性质不同,建议先进行预实验摸索酶使用浓度及酶切反应时间。
本品不含标签,后续如需去除重组肠激酶,可用阴离子交换树脂(eg.DEAE-FF) 对其进行洗脱。