应用方向HRP/AP酶标二抗常用显色液:TMB、pNPP、BCIP/NBT

基于免疫学基本原理（抗原与抗体特异性结合），衍生出一系列针对蛋白研究的相关实验，但影响免疫学实验（如Elisa、WB等）显色成功的因素有很多，除了抗原抗体反应外最关键的是实验最后一步——加入底物，酶与底物反应后通过肉眼观察或酶标仪读取 OD 值来分析样本。根据不同的酶：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），所作用的底物有所不同。小翌已为您准备好了几款常用的显色底物，下面一一为您介绍下：

TMB，即3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine，中文全称3,3',5,5'-四甲基联苯胺，是辣根过氧化物酶（HRP）的常用显色底物之一。在HRP的催化下，TMB被过氧化氢（H2O2）氧化生成蓝色产物。主要吸收峰在370 nm和652 nm。在加入硫酸或者磷酸终止上述反应后，产物转变为黄色，最大吸收峰为450 nm。

图1 .TMB显色原理

传统的TMB显色试剂通常以AB液形式提供（TMB和H₂O₂溶液分到两管，仅在使用前才可混合使用），并且容易产生沉淀，使用起来相对不方便，且容易导致操作误差。为克服以上缺点，我司采用新的TMB显色技术，将所有相关试剂全部混合配成单一溶液。具有以下优点：

另外，TMB溶液可分为沉淀可溶型和沉淀不可溶型，前者适用于ELISA及其他通过液体反应检测HRP的应用，后者适用于WB或其他通过沉淀反应检测HRP的应用。

pNPP，即4-Nitrophenyl phosphate disodium salt，中文全称4-硝基苯磷酸二钠，是碱性磷酸酶（AP）的底物，在酶（如碱性磷酸酶，AP）和辅助物质（如缓冲液和金属离子）存在的条件下，pNPP可以被酶催化水解为对硝基苯酚（pNP），pNP是一种黄色产物，其吸收峰位于405 nm左右。pNPP常用于基于AP标记的ELISA。本产品具有本底低、稳定性高、批间差小的特点，提供了优越的信号反应体系，适用于显色时间≤20分钟的检测实验。

图2.pNPP显色原理

5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP）/硝基四氮唑蓝（NBT）是碱性磷酸酶(AP)的最佳底物组合之一。碱性磷酸酶是一种常用于酶标记实验的酶，它可以催化底物BCIP的水解和NBT的还原。在BCIP的水解过程中，产生的5-溴-4-氯-3-吲哚在碱性条件下氧化为有色产物。同时，NBT在还原条件下被还原为紫色产物。这些有色产物可以在细胞或膜上形成可见的紫色或紫褐色沉淀，用于定性或定量检测酶的存在或活性。

传统的BCIP/NBT显色试剂通常需要在使用前混合（NBT和BCIP溶液分到两管，同时反应需要添加碱性磷酸酯酶显色缓冲液），使用起来相对不方便，且容易导致操作误差。为克服以上缺点，我司采用新的BCIP/NBT显色技术，将所有相关试剂全部混合配成单一溶液。具有以下优点：

【注】已全部换算为100 mL体系产品价格

图3.Yeasen产品与其他品牌同级别产品价格比对

Q1：背景显色太深

1）如果背景（没有样品的对照）显色太深，一方面需考虑使用适当的封闭液进行封闭，如商业化的封闭液或者商业化的和一抗相同来源的血清（5-10%）进行封闭。另一方面，直接使用经过适当亲和吸附的二抗，以减小二抗的非特异性交叉吸附。

2）可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。

3）可考虑TMB底物本身反应过于强烈。为了避免沉淀的产生，可在终止反应后马上读数，或者进一步稀释一抗和/或HRP结合物。

Q2：没有显色或显色太弱

1）适当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在离心管内，检测二抗是否被正常显色。

2）可以考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。

3）可以适当延长显色时间。

4）如果上述改进不能获得预期效果，可以考虑更换效果更好的一抗或ELISA试剂盒。

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